用途

美国FOCUS西尼罗河（West Nile）病毒IgG ELISA，利用了西尼罗重组抗原检测人体血清或血浆中的西尼罗抗体。本实验仅用于辅助诊断人感染了西尼罗病毒，不用于筛查血液或血液成分。仅供专业人员体外诊断使用。

概述

 感染了西尼罗病毒会导致包括脑炎等一系列症状的疾病，西尼罗病毒在世界广泛传播，已在50多个国家检测出该病毒。本试验经CDC提供的试剂检验与验证。本试验使用了一种称为WNRA的重组抗原，它可以作为西尼罗病毒感染的快速血清学指标，WNRA蛋白是一种重组抗原，它是由含有西尼罗病毒两个抗原的序列多肽构成。

实验的原理

检测西尼罗病毒IgG ELISA 是基于两步夹心法原理制造的。

提供的材料

1.        微孔板（96孔 12x8）：即用 每孔均包被结合西尼罗重组抗原的单抗。2－8℃下保存至保质期。

注意：WNRA和NCA已包被于微孔板。

2.        IgG样品稀释液：1支 25ml 即用 2-8℃下保存至使用。

3.        IgG阴性质控：1支 30ul  2-8℃下保存至使用。要长时间储存，将其分装于小瓶里，在-70℃下储存。

4.        IgG阳性质控：1支 30ul  2-8℃下保存至使用。要长时间储存，将其分装于小瓶里，在-70℃下储存。

5.        洗涤液（10X）：1瓶 120ml  2－8℃下保存至使用。

6.        EnWash：1瓶 20ml 2－8℃下保存至使用。

7.        酶联物：一瓶6ml 即用 2－8℃下保存至使用。

8.        TMB底物液： 1支 9ml 即用  2－8℃下保存至使用。

9.        终止液；1支6ml 即用 2－8℃下保存至使用。

试剂应避免反复冻融。

操作步骤

在使用前将所有试剂和样品平衡至室温，并轻轻倒转使其充分混匀。

实验准备：

将10X的浓缩洗涤液稀释,将120ml的浓缩洗涤液加上1080ml的蒸馏水，摇匀，至无任何沉淀，稀释好的洗涤液最多可在室温下放置两个星期。

准备实验所需的板条，剩余的板条应尽快放入袋子里重新密封，在2－8℃下储存至保质期。

操作步骤

1.     标记将要使用的板条，注意微孔板已经按照统一排列，如下所述包被西尼罗抗原和质控抗原。

西尼罗抗原
	板条＃1	板条＃2
A	WNRA	WNRA
B	WNRA	WNRA
C	WNRA	WNRA
D	WNRA	WNRA
E	NCA	NCA
F	NCA	NCA
G	NCA	NCA
H	NCA	NCA

2.     将血清样品﹑阴性质控和阳性质控同样地用样品稀释液按1：300稀释。

3.       每孔加入50ul稀释后的样品，以下为一个血清样品使用一个板条的典范。

	板条1	板条2
	血清样品
A	IgG N		样品1
B	IgG N		样品1
C	IgG P		样品2
D	IgG P		样品2
E	IgG P		样品2
F	IgG P		样品2
G	IgG N		样品1
H	IgG N		样品1

4.       封板，在湿润的温育器里37℃下温育1小时。

5.       温育后，用自动洗板机，使用洗涤液洗板6次。

6.       在每孔中加入50ul的酶联物。

7.       封板，在湿润的温育器里37℃下温育1小时。

8.       温育后，用自动洗板机，使用洗涤液洗板6次。

9.       每孔加入150ul的EnWash，在室温下温育5分钟

10.   温育后，用自动洗板机，使用洗涤液洗板6次。

11.   每孔加入75ul的TMB底物液。

12.   封板，在室温下，避光处温育10分钟。

13.   每孔加入50ul的终止液终止反应。

14.   在450nm处读取吸光率。

结果的计算

结果的变化将会非常大，以下结果仅供指引。

计算ISR值：

计算在同一实验里WNR抗原的两个阴性质控的平均值，计算同一实验里NC抗原的两个阴性质控的平均值，用WNRA/NCA，得出阴性质控的ISR值。同样地计算阳性质控和样品得ISR值，阳性质控的ISR值应高于3.0，阴性质控的ISR值应低于1.5。

ISR	结果	解释
≤2.0	阴性	没有检测到IgG抗体
2.0－3.0	可疑	需确证实验
≥3.0	阳性	存在IgG抗体，建议做确定性实验

结果的判断：

在某些特殊的例子中，曾报道有假阳性，但对梅毒病人无限制。假如样品的ISR值大于2.0，但是WNRA和NCA的OD值均偏低，可视为潜在假阳性。以下为样品1排除标准的范例。

排除标准：

计算阴性质控的WNRA和NCA值：

	WNRA	NCA
NO.1	0.153	0.126
NO.2	0.125	0.110
总计	0.260	0.236

平均WNRA=0.260/2=0.130

     NCA=0.236/2=0.118

     ISR=0.130/0.118=1.10

任何阴性质控的ISR值高于1.5，则实验需要重做。

计算阳性质控的WNRA和NCA值：

	WNRA	NCA
NO.1	0.635	0.190
NO.2	0.655	0.178
总计	1.290	0.368

平均WNRA=1.290/2=0.645

     NCA=0.368/2=0.184

     ISR=0.645/0.184=3.5

任何阳性质控的ISR值低于3.0，则实验需要重做。

以下标准是必需遵守的，不满足以下标准，试剂出现了质量问题或操作错误，实验需重做。

因素	范围
平均阴性质控读数	＜0.400
平均阳性质控读数	＞0.400
阳性质控的ISR值	＞3.000
, , 阴性质控的ISR值	＜1.500

解释结果

1.       样品的ISR值大于3.0视为阳性。

2.       阳性结果需重做证明。

3.       样品的ISR值小于2.0视为阴性。

4.       样品的ISR值小于3.0但是大于2.0，视为未确定，但是很有可能阳性，实验需一式三份重做。

5.       ISR值大于2.0是因为WNRA和NCA的值都低造成的，应该视为潜在假阳性。

样品1低OD值的范例：
计算样品的WNRA和NCA值：

	WNRA	NCA
NO.1	0.044	0.190
NO.2	0.016	0.007
总计	0.060	0.026

平均WNRA=0.060/2=0.030

     NCA=0.026/2=0.013

     ISR=0.030/0.013=2.31

虽然样品的ISR值高于2.0，但是本样品需视为假阳性，因为其OD值低，而且远远偏离了相关的标准品，这通常在空白值高的情况下发生。

要进一步证实样品，所有阳性的结果都要用6，2层析稀释滴定法重做，与相同滴定法的阴性质控相比较，假如曲线是？？的，平的或者是波浪型的曲线，则表明为假阳性的结果。

实验的局限性

1.           样品的OD值高于抗原质控（非WNRA）,导致ISR值小于3.0，则可能为假阴性，再释稀样品重新实验，可能会获得真正的ISR值。

2.          既然这不是一个直接检测的方法，则需考虑假阳性和假阴性存在的可能性。

3.          所有有反应的样品，应用确定性实验来证实。

4.          本实验提供的试剂，尽可能地检测血清或血浆中的WNRA反应性抗体水平。

5.          应避免反复冻融样品和试剂。

6.          不要使用溶血或脂血的样品，它们会导致错误的结果。

中国地区代理商 广州健仑生物科技有限公司
【联系电话】 020-82574011 13802525278 13710007117  
【公司传真】 020-32206070
【电子邮件】 Service@jianlun.com  Jim@jianlun.com
【腾讯 QQ】 712628580 712628581 712628582
【公司网址】 www.jianlun.com 
【营销中心】 广州市中山大道中358号东溪大厦B座511室
【公司地址】 广州市天河区车陂第十五工业园一幢4067室 

该说明书由健仑生物技术人员编译，请与英文原文为准，谢谢!