1. 传统分离培养检测及鉴定方法
食品中单增李斯特菌的传统检验方法是将分离培养后的可疑菌落做生化反应实验、溶血实验、协同溶血实验(CAMP)、动物实验及典型运动等鉴定,被确定为李斯特菌后进一步进行血清分型; 增菌和选择性增菌是不可缺少的步骤,而增菌主要包括两种:冷增菌和快速增菌。前者是将样品置于胰蛋白胨水中4℃～5℃增菌1个月,再划线分离;由于冷增菌时间长(4℃, 30 d甚至1年),已被快速增菌法取代。国际常用的增菌法主要有国际乳业联盟(IDF)、美国食品药品管理局(FDA)及美国农业部(USDA)的增菌法。IDF法是将待检样品接IDF法是将待检样品接种于EB培养基,经30℃, 48h培养后,于OXFORD平板划线分离,选择培养,然后用斜光法观察菌落, CAMP检验,最后鉴定分型。 FDA为美国官方负责食品卫生监督的机构,其所制定的方法为国际上公认的权威方法之一,因此许多检测方法都以FDA法作为对比参照。其主要步骤是将样品接种在含放线菌酮的LEB肉汤中培养,分别在第1天和第7天转接在MMLA平板上分离。USDA法是将样品接种在UVM-LEB(university of Vermont modified Lisiteria enrichment broth)肉汤中,再转到FB(Fraser broth)培养基中,分别在30℃和35℃两次增菌,于MMLA或MOX平板上划线分离。

除上述3种方法外,国际标准化组织(ISO)在ISO11290-1中采用增菌液为DFB(demi-fraser broth)和FB的两级增菌法。另外还有一种RSK法,也是采用两次增菌, 20h可使单增李斯特菌达到107个/ml。我国使用的检测单增李斯特菌方法主要有国标法(GB 4789.30-1994)和SN法(SN0 184-1993)。

国标法在LEB中前增菌后,划线于选择性培养基MMA,再分别于SIM和TSI上分离培养,其后于TSA-YE培养基上纯化菌落,进一步做生化鉴定,报告结果。SN法一般将样品置于MBP中前增菌,然后在EB中增菌,分别划MMA和OXA平板,于TSA-YE平板上纯化菌落,纯化的菌落接种于TSB-YE中培养过夜进行生化实验,报告结果。

2. 显色培养基快速鉴定技术
基本原理：针对单增李斯特菌的β-D-葡萄糖苷酶和毒力因子PI-PLC酶,设计相应的底物,加入到常规选择性培养基中,利用酶对底物的分解,产生荧光物质或显色物质,使其菌落形态或颜色不同于其他李斯特菌和非李斯特菌,从而实现对单增李斯特菌快速定性鉴定和菌落数目的快速定量。Notermans等1991年首次用plcA基因产物磷脂酰肌醇(PI)特异性的磷脂酶C(PI-PLC)来检测单增李斯特菌,通过与L-α-磷脂酰肌醇显色底物进行特异性生化反应,在菌落周围产生不溶于水的脂肪酸,形成明显的沉淀环,实现对单增李斯特菌的一步鉴定。另一种PI-PLC的底物是5-溴-4-氯-3-吲哚-肌醇-1-磷酸盐,致病性的单增李斯特菌在以该底物设计的显色培养基上呈现出绿色的菌落,无致病性李斯特菌为白色菌落。Facon和Simon于1998年利用该物质作底物开发成功显色培养基并申请了专利。在同一年, Schabert和Restaino利用4-甲基伞形酮-肌醇-1-磷酸盐作为PI-PLC酶的底物,开发出荧光显色培养基,也申请了专利。 

3. 数值分类鉴定和新型计数技术
对传统的生化反应进行统计分析,找出代表李斯特菌的特征性生化反应,利用数值分类技术,编出相应的代码表,简化传统的生化鉴定步骤,达到快速鉴定。最有代表性的就是现在商业化的微量生化鉴定管,其中最常用且普遍被认可的是TheAPI-Listeria test。它共包括10个生化反应,通过查询代码表可以对单增李斯特菌和李斯特属内的菌种快速鉴定。传统的计数以平板计数和MPN两种方法为主。传统的计数以平板计数和MPN两种方法为主。目前有多种技术将常规培养方法进行了改进或替代,主要体现在勿需琼脂平板或简化琼脂倾注平板。其中的疏水网膜(HGMF)技术适用于好氧菌计数,它采用的ISO-GRIO系统,具有1600个小方格的网膜,能浓缩样品细菌,除去抑制物,同时利于细菌在培养基间转移时活力的恢复。 

4. 免疫检测技术
Farber等首先于1987年报道了针对单增李斯特菌鞭毛抗原的单克隆抗体ELISA检验程序。首先用硝酸纤维素膜过滤污染样品,然后将滤膜置于改良的McBride李斯特菌分离培养基上,在30℃下培养48 h后移去膜,用对单增李斯特菌特异的单抗酶免疫法检验,该法可在2～3 d内从自然污染样品中检出单增李斯特菌。1992年,Bessesen等利用淋巴细胞杂交瘤技术,首次制备一株能稳定分泌抗单核增生李斯特菌特异性克隆抗体的细胞株em-7g1,所针对的蛋白质分子量为60kd。以此特异的单克隆抗 体建立的夹心ELISA方法能于20～24 h内检测出8～10 cfu/g(ml),这在病原性李斯特菌的检测方面实现了一次重大突破,第一次利用免疫学方法把单增李斯特菌与非病原性李斯特菌分开。以抗原抗体免疫为基础, Tao Geng等(2004)研制的生物传感器可在24h内检测出热狗和香肠中污染的单增李斯特菌,增菌后可检测10～100 cfu/g样品。

5. 分子检测技术
5.1　探针检测技术　
Data等1988年克隆出单增李斯特菌β溶血素基因的一个500bp DNA片断并测序,以此序列合成4种寡核苷酸探针,以32P标记该探针经斑点杂交试验证实,该探针只与单增李斯特菌反应,与其他种的李斯特和属外的细菌均呈阴性,表现出很好的特异性。Notermans S.等1989年克隆出编码单增李斯特菌和英诺克李斯特菌的引起迟发性变态反应的基因(DTH-18)。该基因经32P标记制备成基因探针,通过斑点杂交能检出绝大多数血清型的单增李斯特菌和英诺克李斯特菌。除了DNA分子可作为很好的靶序列外, RNA也是个很好的选择,VITR Listeriakit就是针对RNA开发的探针试剂盒。Roger Stephan等(2003)报告3h内可得到结果,效果非常好。

5.2　PCR检测技术　
用于PCR检测的特异引物,一种是依据单增李斯特菌的特异毒力基因序列设计,常以hlyA、iap、inl、Dth-18作为靶序列。Xiaohui Zhou等2003年以actA作为靶序列,设计引物,扩增产物827bp,对单增李斯特菌有很高特异性,经过在LEB中30℃16h增菌后,可达到在25g牛肉、25ml水或牛奶中检出10cfu的水平。另一种是以单增李斯特菌的16S序列或16S/23S中间保守区域为靶序列设计引物,用PCR技术对单核增生李斯特菌的特异性进行研究。 定量PCR技术的发展,科研人员开始尝试以分子手段对单增李斯特菌快速计数。Nogva et al运用5′-核酸酶PCR对单增李斯特菌定量,Weon Sang Choi等运用cPCR对单增李斯特菌进行定量。近年来采用PCR技术对单增李斯特菌检测,研究重点放在了样品前处理方面。 G.Amagliania等利用顺磁纳米颗粒和传统的苯酚、氯仿对样品中DNA进行更有效提取,以去除对PCR扩增的抑制因素,尽量避免培养增菌过程,从而大大提高特异性和减少检测时间。现在已经有很多基于PCR技术开发的商业化试剂盒,其BAX_system已在2002年被英国农业食品安全和监测局(FSIS)采纳用来检测鲑鱼中的单增李斯特菌。B.Becker等报告BAX系统检测27个样品,其中26个与标准方法DIN11290-1和DIN 11290-2一致,只有一例假阳性。在自然污染的样品检测中,培养24～48h后即得到较好的结果。

5.4　免疫-PCR检测技术　
Fluit等将免疫技术和PCR技术相结合,建立了新的检测系统磁免疫PCR。它以单增李斯特菌单抗MAb55和MAbA包被磁珠,对样品进行前处理,将菌富集裂解,再以DTH基因设计引物进行PCR,并以hlyA基因设计引物做进一步验证,显示单抗MAb55效果较好,可检测出每g样品一个细菌,十分灵敏。

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徐进 

2010/12/09