背景简介
　　视黄醇结合蛋白( retinol-binding protein ,RBP) 为血中维生素A（VitA）的特异转运蛋白。目前已发现七种不同的RBP亚型，主要分布于血液循环系统（RBP4，简称RBP）、细胞（RBP1，RBP2，RBP5，RBP6，RBP7，简称RBPs）和视网膜光感受器间（RBP3，简称IRBP）。RBP4(Retinol-binding protein 4；RBP4；NM_006744) 为一种单一肽链蛋白质。 
肾小管疾病导致肾小管蛋白重吸收功能下降时，尿液中RBP4含量就会上升,在病情进行的初期约1-3mg/24h，严重时高于3mg/24h以上。（以正常人每天排尿量1.5升计算，约为0.67-2ug/ml,为正常人的10倍以上）,故尿液中RBP4增高具有早期诊断意义,是一种评价肾脏疾病特别是肾小管损伤疾病的良好指标。此外，肝胆系统疾病，如病毒性肝炎早期等、甲状旁腺功能亢进、营养不良均可引起血中RBP4降低，而慢性肾脏疾病时则升高。 
本公司提供一种检测视黄醇结合蛋白的免疫胶体金试纸条，该试纸条操作简便、快速、准确，全过程只需10分钟，不受环境条件的干扰，特异性好，且检测灵敏度高，最低检测限为1ng/ml。本发明使用于医院常规检测，可实现尿样中视黄醇结合蛋白4的快速检测。

具体实验方法：
　　1.天然RBP4蛋白提取工艺的确定 
　　视黄醇结合蛋白在肾小管损伤疾病病人的尿液中含量较之正常人尿样中含量高出10倍以上。故从肾小管损伤疾病病人的尿液中可以提取天然视黄醇结合蛋白。纯化采用亲和层析的方法，使用的是GE Healthcare AKTA 纯化系统，采用的纯化柱也是购自GE公司。讲病人的尿液进行预处理后，通过具体的纯化工艺包括离子交换柱、疏水层析、分子筛方法得到了天然的RBP4蛋白(图1) 


如图1：泳道1是蛋白Marker；泳道2-5是第一批肾小管损伤病人尿液样品经过离子交换层析、疏水层析和分子筛后分管收集的蛋白样品；泳道6-9是第二批肾小管损伤病人尿液样品经过离子交换层析、疏水层析和分子筛后分管收集的蛋白样品。 




　　 2.RBP4单克隆抗体的制备 
　　最终筛选得到3株杂交瘤细胞株，效价见表 1：

　　表1 3株杂交瘤细胞株的抗体效价及亚型鉴定 
　　*此效价是指在培养杂交瘤细胞时上清中的抗体的效价 

　　3. RBP4单克隆抗体的鉴定和分析 
　　（1）尿液中RBP4蛋白的免疫印迹检测 
　　样品：阳性对照纯化好的天然视黄醇蛋白；肾小管疾病病人尿液P1，P2，P3（来源于上海第六人民医院肾脏科）；正常人尿液N1，N2，N3；阴性对照是BSA。样品上样量：5μl。 
　　 实验结果见图2（克隆号S-113-7单克隆抗体实验结果图）和图3（克隆号SA-64-11单克隆抗体实验结果图）。结果表明，所制备的抗RBP4鼠单克隆抗体能够有效的识别肾小管疾病病人尿液中的RBP4，而对正常人尿液中的痕量RBP4没有反应（免疫印迹法一般仅能检测1ng以上的目的蛋白，而试验时每个泳道本发明人仅加了5μl尿液，按照正常人尿液的RBP4水平，其中所含的RBP4不足1ng）。 

　　（2）抗体配对以及ELISA试剂盒构建 

　　从图中我们可以看到，这两株单克隆抗体识别RBP4的不同位点，可以很好的配对，双抗体（S-113-7和SA-64-11）夹心ELISA：灵敏度：1ng/ml，线性范围：1-10ng/ml，可以用于制备RBP4检测试剂盒。
　　 
　　（3）胶体金快速检测试纸条的小样本临床试验 
　　来自上海市第一人民医院的肾脏损伤和肾移植病例40例尿样开展小样本临床试验。首先对40例样本进行ELISA检测（上海德波），确定其中所含RBP4蛋白的含量。

试纸条检测结果：  阴性（RBP4<100ng/ml）	商业RBP ELISA试剂盒结果：
弱阳性（100ng/ml<RBP4<1000ng/ml）
强阳性（RBP4>1000ng/ml）

RBP4金标快速检测试纸条产品形态：  通过比对发现所有100ng/ml以下的尿样在胶体金免疫层析试纸上均为阴性结果；所有100ng/ml以上的尿样在胶体金免疫层析试纸上均为阳性结果。同时，1000ng/ml以上的尿样以及15号尿样（944ng/ml）均为强阳性结果，其他为弱阳性结果。因此，以100ng为阳性判定结果，我们的胶体金免疫层析试纸与商业ELISA试剂盒的符合率为100%。

取得成果 
　　制备了针对RBP4蛋白的高亲和力单克隆抗体，并运用该单克隆抗体配对组装成ELISA检测试剂盒和胶体金快速检测试纸条。 
　　ELISA试剂盒灵敏度达到1ng/ml，线形检测范围为1-10ng/ml。 
　　胶体金试纸条检测限为100ng/ml。进行了小样本临床试验。临床试验表明，所有RBP4含量在100ng/ml以下的尿样在胶体金免疫层析试纸上均为阴性结果；所有100ng/ml以上的尿样在胶体金免疫层析试纸上均为阳性结果。同时，1000ng/ml以上或接近的尿样均为强阳性结果，所研发的胶体金免疫层析试纸与商业ELISA试剂盒的符合率为100%。 
　　申请国家发明专利3项： 
　　视黄醇结合蛋白单抗、其杂交瘤细胞及其制备方法和用途（200910055428.5） 
　　RBP4单抗、其杂交瘤细胞及其制备方法和用途（200910055429.X） 
　　RBP4杂交瘤细胞株及其制备方法和用途（200910055427.0）
　　Reference:
　　evelopment of retinol-binding protein 4 immunocolloidal gold fast test strip using high-sensitivity monoclonal antibodies generated by DNA immunization. Acta Biochim Biophys Sin(2010)42(12):847-53