背景简介
　　前列腺癌是中老年男性的常见多发病，在男性所有类型癌中占10%～20%, 是男性最常见的癌肿。测量血清中的前列腺特异抗原PSA可以用于筛选和早期诊断前列腺癌。它是公认的诊断前列腺癌的较好的肿瘤标志物，其诊断前列腺癌的特异性为82%-97%。前列腺特异抗原(prostate specific antigen , PSA) 是与前列腺癌相关的一种抗原，属糖蛋白类物质。PSA和肛诊是目前第一线家庭医师或泌尿科医师们筛检早期前列腺癌的重要工具。 

试剂盒研制开发流程和结果： 
　　1.PSA单克隆抗体的制备 
　　最终筛选得到5株杂交瘤细胞株，分别测定其亚型，并通过竞争ELISA实验进行表位分析。其中3株在之后的抗体配对实验中验证配对，其效价见下表。

Clone	Ab Titer(OD450±SD)	Ig subclass
S-44-10	2.350±0.079	IgG1,κ
S-102-11	20612±0.011	IgG2a, κ
S-191-5	2.332±0.081	IgG1,κ

　　*The supernatant was from the culture of 1×106 hybridoma cells in 9 ml medium for 3 days.

　　2.建立ELISA检测试剂盒体系 
　　（1）抗体配对分析 
　　将获得的5株单克隆抗体分别进行纯化和标记，进行两辆交叉配对试验，最终筛选到两组配对可用于双抗体夹心法的ELISA试剂盒：S-44-10 (A) — S-191-5 (D)- HRP，S-102-11(B) — S-191-5(D)- HRP。 分别用于检测总PSA （tPSA）和 游离PSA ( fPSA)。 
　　如下图所示（A：S-44-10抗体 B：S-102-11抗体 D：S-191-5抗体） 

　　（2）两种试剂盒的检测标准曲线的建立（双单抗夹心法） 
　　经摸索优化试剂盒中各种成分，最终选定了相应的原料使用浓度、试剂配方和反应条件。如图所示：此两种试剂盒检测标准品均具有很好的线性关系。 

　　(3) 试剂盒标准品 
　　标定是测定的基础，利用 NIBSC国际标准品对fPSA和tPSA试剂盒进行标定。 
　　NIBSC国际标准品：

• a. Prostate Specific Antigen (90:10) 96/670 (WHO International Standard or Reference Reagent);
• b. Prostate Specific Antigen (free) 96/668 (WHO International Standard or Reference Reagent);
  

  本公司利用基因工程技术，在昆虫真核系统中通过昆虫细胞杆状病毒系统表达并纯化了重组的PSA，重组PSA用NIBSC标准品标定后，可以作为两种试剂盒中的参照品使用。重组PSA作为试剂盒标准品的鉴定，如下图所示。 

　　(4)小样本临床实验 
　　将自行研制的试剂盒测定PSA临床样本（27份阳性+30份阴性）, 以瑞典CanAg公司的试剂盒作为比较参照。

		自制试剂盒
		癌症	非癌症	合计
Canag试剂盒	癌症	a	b	C
	非癌症	c	d	D
	合计	A	B	H

　　 30份临床阴性血清T-PSA两种试剂盒测定结果对比图 
 
　　27份临床阳性血清T-PSA两种试剂盒测定结果对比图 
 
　　30份临床阴性血清F-PSA两种试剂盒测定结果对比图 
 
　　27份临床阳性血清F-PSA两种试剂盒测定结果对比图 
 
　　诊断标准：小样本临床试验设定的前列腺癌本试剂盒诊断标准为：
　　1）当tPSA > 10 ng/ml 判为阳性； 
　　2） 当tPSA 处于灰区2.5 -10 ng/ml时， 则采用fPSA/tPSA < 0.25 判为阳性。 

		自制试剂盒
		癌症	非癌症	合计
Canag试剂盒	癌症	24	1	25
	非癌症	0	32	32
	合计	24	33	57

　　（5）PSA试剂盒特性测定 
　　线形范围、灵敏度：

　　试剂盒准确度： 

　　试剂盒特异性： 

　　试剂盒变异度： 
　　10ng/ml的样本，测量8次，批内变异度CV = 8.00%, 符合 CV < 15% 的要求。

取得成果 
　　已研发出分别针对血清中游离PSA（f-PSA）以及总PSA（t-PSA）的检测试剂盒，首次建立了“一步法”快速反应操作体系与流程，将整个操作过程时间缩短到了一小时以内。建立和优化了夹心ELISA法检测体系，包括试剂盒各组分的确定，各组分配方、使用条件及参数的优化，检测标准曲线的建立以及诊断标准的确定等。用NIBSC国际标准品对f-PSA及t-PSA两种检测试剂盒进行了标定，并通过基因工程手段自制了重组PSA蛋白，用国际标准品标定后，可用于两种试剂盒参照品。 
　　F-PSA试剂盒灵敏度为0.46ng/ml，准确度为94.1%，特异性为100%，批内变异度为8%；T-PSA试剂盒灵敏度为0.50ng/ml，准确度为94.1%，特异性为100%，批内变异度为8%。 
　　小样本临床试验证实本试剂盒与 Canag产品性能相似，57例样本检测的诊断结果对比显示灵敏度 = 24 / 25 x 100% = 96.0% ,特异度 = 32 / 32 x 100% = 100% ,准确率= ( 24 + 32 )/ 57 x 100% = 98.2%。