作者：邓淑珍，张海林，李金梅    作者单位：1.大理学院公共卫生学院，云南 大理 671000； 2.云南省地方病防治所/云南省病毒立克次体研究中心，云南 大理 671000. 

【摘要】  　　流行性乙型脑炎病死率较高，后遗症严重，在亚洲地区危害较大。本文就乙脑病毒的分类、抗原特性、对细胞和动物敏感性、基因组的结构特征、毒力基因、基因分型和疫苗等方面的研究进展作一综述。

【关键词】  流行性乙型脑炎病毒；生物学特性；分子特征；疫苗

　　流行性乙型脑炎（简称乙脑）国际上称为日本脑炎（Japanese encephalitis）。本病是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus）经蚊虫媒介叮咬传播而引起的一种中枢神经系统感染的急性传染病，也是一种人兽共患的自然疫源性疾病。临床上以高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激征为特征。病死率较高，而且后遗症严重。本病对人类健康危害较大，现就乙脑的病原学研究进展综述如下。

　　1 乙脑病毒分类及抗原特性

    乙脑病毒在分类上属于黄病毒科（F1aviviridae）黄病毒属（F1avivirus）成员。在黄病毒属中按抗原组划分，乙脑病毒抗原组包括乙脑、西尼罗和圣路易脑炎病毒。黄病毒成员之间存在着不同程度的血清学抗体交叉反应，而抗原组内不同病毒之间交叉反应更为严重，因此在血清学检测和判定时要充分考虑相关病毒交叉的可能［1,2］。

　　2 乙脑病毒对细胞和动物敏感性

    乙脑病毒能在BHK21、Vero、LLC-MK、C6/36等传代细胞或猴肾、地鼠肾、鸡胚纤维母细胞和猪肾等原代细胞中增殖，并产生细胞病变效应(CPE)。细胞感染病毒后第3～5d开始出现CPE，病变的特点是单层细胞出现变圆、脱落及破裂，在C6/36细胞上可出现细胞融合形成空泡。C6/36细胞是乙脑病毒最为敏感的细胞，已广泛应用于乙脑病毒的分离和有关研究中。乙脑病毒能在BHK21、LLC-MK2和Vero等细胞上产生蚀斑。乙脑病毒脑内接种乳小白鼠较为敏感，乳鼠可出现以驰缓性麻痹为主的脑炎症状而死亡。潜伏期3～4d。主要症状是行动迟缓、离群、耸毛、尾强直、抽搐、四肢麻痹，最终死亡。该病毒也能引起幼年小白鼠（8～10g）或成年鼠发病死亡。

　　3 乙脑病毒基因组的结构特征

    乙脑病毒基因组为单股正链RNA，全长约11kb，乙脑病毒各地代表株的全核苷酸序列均有发表。乙脑病毒的基因结构为5’端有95个核苷酸的非编码区接着一段10 296个核苷酸的编码区，随后是585个核苷酸的3’ 端的非编码区。乙脑病毒的基因组只有一个开放读码框，其编码是由3个432个氨基酸组成的多聚蛋白前体，该多聚蛋白前体在宿主细胞内，在病毒自身编码的蛋白酶（NS3）及胞内其它酶类作用下，形成3个结构蛋白（C，PrM和E）和7个非结构蛋白（NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5），基因顺序为：5’cap-NCR-C-PrM-M-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3’NCR（cap：帽状结构，NCR：非编码区，C：核衣壳蛋白，PrM：前膜蛋白，M：膜蛋白，E：包膜糖蛋白；NS：非结构蛋白）［3,4］。PrM、E和NS1糖基化，均有免疫保护作用。prM蛋白是未成熟病毒体的一部分，在病毒感染后期，它可以诱导保护性免疫，E蛋白基因大小为1 500 bp，编码500个氨基酸残基，囊膜糖蛋白E是主要的毒力抗原，E蛋白上有特异性抗体的中和表位，可诱导免疫动物产生中和抗体。NS1是糖基化蛋白，为乙脑病毒的保护性抗原，而NS1蛋白为可溶性补体固定原。

　　4 乙脑病毒毒力基因

    已发现影响乙脑病毒毒力的相关因素很多, 如病毒与细胞受体结合的能力、病毒与细胞融合的速率、病毒RNA 合成酶的合成速率等,都会不同程度地影响该病毒的毒力。通过对减毒株和野毒株的比较研究发现影响乙脑病毒毒力的7个共有氨基酸突变位点，即E138（Glu-Lys）、E176(Ile-Val)、E315(Ala-Val)、E439(Lys-Arg)、Ns2-63（Glu-Asp）、NS3-105((Ala-Gly)、NS4B(Ile- Val),其中有4个位点集中在E基因区，其余变异位点分布在非结构基因，表明影响毒力的因素不仅限于 E基因。其它一些突变位点属于非共同的氨基酸突变位点，分别分布在结构基因和非结构基因部位，但这些非共同的氨基酸突变位点是否对乙脑病毒毒力有影响尚需进一步研究［5,6］。
　　Sumiyoshi等的研究也证明，E蛋白在乙脑病毒毒力中占有重要位置，E基因的单点突变即可使乙脑病毒丧失其神经毒力/侵袭力［7］。进一步的研究发现，SA14-14-2减毒株与其母株SA14野毒株的E区比较共有8个氨基酸残基差异，具体位置在E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315和E439位，是毒力减弱的关键氨基酸残基位点［6,8］。还发现AT31和AT222E蛋白上E138和E176位点氨基酸变化可能改变了E蛋白对细胞受体的吸附性，或者引起该病毒对其他细胞不可穿透，导致病毒毒力减弱，E138和E176一起对乙脑病毒强毒株在连续性传代过程中毒力减弱起了关键作用，这2个位点上的氨基酸是决定乙脑病毒病原性的关键氨基酸，与乙脑病毒神经毒力密切相关［9］。因此，利用E蛋白这一分子生物学特性，以开发更有效，更廉价的乙脑疫苗［10,11］。

　　5 乙脑病毒基因分型

    首先由Takegami（1982）将乙脑病毒分为 3 个血清型（Ja Gar、 Nakayama 和 Mie型）。进一步的研究，依据交叉中和试验，RNA 寡核苷酸指纹图谱、基因序列以及单克隆抗体的交叉反应性,可将乙脑病毒分为5 抗原组，即Nakayama2RFVL(分离自日本东京)、Kamiyama(分离自日本福冈)、691004(分离自斯里兰卡)、Beijing21(分离自中国) 和 Muar (分离自新加坡)。近几年，普遍采用Chen等建立的基因分型法对乙脑病毒进行分型［12,13］。根据核酸序列的同源性，Chen等将乙脑病毒基因分型的cut-off值定为12%的差异度，从而得到进化关系上较为明显的4个型：泰国北部及柬埔寨地区分离的毒株属于基因Ⅰ型；来自泰国南部、马来西亚、印度尼西亚的毒株形成基因Ⅱ型；来自日本、中国等地区的毒株属于基因Ⅲ型；部分印度尼西亚的毒株独自形成了基因IV型［14］。有研究发现同一基因型的毒株在地域上有更为紧密的联系，即有明显的地域性，在同一地区分离的毒株即使年代相差很远也属于同一基因型。但是近十多年来，乙脑病毒基因型的分布地区有了新的变化；中国大陆、韩国和日本已经报道发现基因Ⅰ型乙脑病毒［15,16］；1995年澳大利亚首次出现乙脑病例，其后分离的毒株分别属于基因Ⅰ型和Ⅱ型［17］。近几年，我国对不同来源的乙脑病毒进行了基因分型［16,18～21］，发现分离自我国的乙脑病毒绝大多数是Ⅲ型，并广泛分布于各地乙脑疫区。也证实我国有1型乙脑病毒的分布，最早分离到1型病毒的时间为1977年，认为1型病毒可能是输入的。最近分离到的乙脑病毒大多为Ⅲ型，还从上海、辽宁和云南分离到1型病毒。台湾对不同来源的47株病毒进行研究，可分为1、2和3群（型）［22］。乙脑病毒4个型之间具有较强的交叉保护作用，在血清学和免疫学试验中也有较强的交叉反应，用血清学试验难以区分乙脑病毒的型别。

　　6 乙脑实验诊断技术

    乙脑病毒抗体检测方法较多，如血凝抑制、补体结合、中和、间接血凝抑制、乳胶凝集、酶联免疫和免疫荧光试验等。其中酶联免疫试验检查IgM和IgG抗体是目前用于病人诊断较为常见的方法，由于乙脑病毒与其它黄病毒有交叉反应，近年来由于采用乙脑病毒特异性蛋白制备抗原［23］，该法的特异性和敏感性均有较大提高。其它方法主要用于流行病学调查和实验研究中。病毒分离仍然使用细胞或小鼠法，由于分子生物学方法的发展和逐渐普及，病毒检测更为简便和快速，培养物经过血清学方法初步判定后，用RT-PCR法检测乙脑病毒核酸即可作出准确鉴定，通过序列测定分析可确定分离株的分子遗传特征。实时荧光PCR和基因芯片技术的发展，为乙脑的诊断提供了更好的方法［24］。

　　7 乙脑疫苗及其应用

    控制乙脑流行的方法主要是灭蚊和疫苗接种。在蚊虫控制措施难以全面落实的情况下，疫苗接种成为控制乙脑流行最为有效的方法。目前，国内外应用的乙脑疫苗主要有灭活疫苗和减毒活疫苗两种。灭活疫苗主要是鼠脑纯化灭活疫苗和地鼠肾细胞灭活疫苗。鼠脑纯化灭活疫苗是从感染鼠脑培养制备的，由日本研制生产并得到国际广泛认可和使用的疫苗；地鼠肾细胞灭活疫苗为我国生产，病毒经原代地鼠肾细胞培养制备的疫苗，1998年开始生产使用，随后在全国大面积使用。近几年，Vero细胞纯化灭活疫苗已在研究生产，该疫苗为新一代的乙脑灭活疫苗，有较好的发展前景。减毒活疫苗主要是我国自主研制的乙脑SA14-14-2株，为目前唯一获得认可和推广使用的乙脑活疫苗，自1989年获得新药证书以来，该疫苗产量不断增多，并在全国广泛使用已达3亿多人份，该疫苗具有接种针次少、副反应小、免疫原性高、免疫效果好等优点而在国内得到广泛应用并出口到韩国、尼泊尔和印度等亚洲国家使用［25,26］。然而，由于接种减毒活疫苗后，可在人体内产生感染过程和出现病毒血症，该疫苗病毒能否通过媒介蚊虫叮吸接种疫苗者的血液将病毒传播给健康人而引起疾病，尤其是SA14-14-2病毒通过蚊虫增殖后其弱毒特性和基因型特征能否发生回复突变，毒力增强而发生病毒生态学改变等，仍然是世界卫生组织及专家们最担心和关注的问题。最近，我国学者对现行使用的减毒活疫苗SA14-14-2病毒进行了感染蚊虫实验及安全性评价。研究认为，作为乙脑主要传播媒介的三带喙库蚊和致倦库蚊对SA14-14-2疫苗株的经口感染和病毒在蚊体内的复制严重受限［27］，但经胸腔接种SA14-14-2株后，病毒能在三带喙库蚊和致倦库蚊体内增殖［28,29］。而对照实验表明，这两种库蚊无论经口或胸腔接种野毒株均能在蚊体内增殖，且蚊体内病毒滴度较高。说明减毒疫苗病毒已不具有在蚊虫中肠细胞增殖的特性，即使蚊虫按自然途径（经口）叮吸接种过乙脑减毒活疫苗SA14-14-2病毒的人或动物血液后，疫苗病毒也不会在蚊体内感染增殖，更不会引起疫苗病毒的传播［27～29］，并以此推论媒介库蚊叮吸被该活疫苗免疫的宿主动物和人后，不会引起感染和传播。虽然经非自然途径（胸腔接种），该疫苗病毒可在蚊体内感染复制，但经蚊体内增殖后的疫苗病毒的弱毒特性未发生改变，并通过对该病毒E区的比较分析，获得了SA14-14-2减毒株弱毒特性保持稳定的分子基础，完全符合现行国家药典的规定［30］。该研究首次证实我国自行开发的乙脑减毒活疫苗的应用不会引起该病毒的生态学改变，广泛使用该疫苗是安全的，对该疫苗安全性的证实将促进该疫苗在全世界的推广和使用。
　　基因工程疫苗是乙脑疫苗发展的方向，国内外学者在嵌合病毒疫苗、DNA疫苗、蛋白质疫苗和亚病毒颗粒疫苗方面取得了一些进展。如用乙脑SA14-14-2病毒的PrM和包膜E蛋白基因代替17D黄热病毒cDNA的相应序列，构建了嵌合的减毒乙脑疫苗，免疫鼠和猴子具有安全性、免疫原性和保护作用［30］。用表达的乙脑病毒E蛋白（或含Prm和E 基因；Prm、E、NS1和NS2基因）的重组痘苗病毒免疫小鼠能诱导产生中和抗体及抗乙脑病毒攻击［32］。DNA疫苗研究用构建编码乙脑病毒E蛋白的DNA质粒接种小鼠，对攻击感染有一定保护作用，但免疫鼠中未能检出乙脑病毒抗体，而产生了低水平的乙脑病毒特异性T细胞增殖，认为保护作用可能主要与细胞免疫有关［33,34］。另外的研究用构建的含乙脑病毒Prm和E基因的质粒免疫鼠，能产生较高水平的特异性中和抗体，并对乙脑病毒攻击感染产生完全的保护，免疫猪能产生记忆B细胞和持续产生中和抗体，认为该疫苗可作为第二代乙脑候选疫苗［32,35～37］。有的学者用乙脑病毒NS1基因的质粒免疫小鼠，对乙脑病毒攻击产生保护性免疫［38］。用乙脑病毒Prm和E蛋白组成的细胞外颗粒（EPs）免疫小鼠能产生特异的中和抗体和T淋巴细胞［39］。虽然基因工程疫苗有良好的发展前景，但在临床使用前尚有很多问题需要解决。

【参考文献】
  　［1］Karabatsos N ed．International Catalogue of Arboviruses lncluding Certain Othre of Vertebrates［M］．3rd ed，American Society of Tropical Medicine and Hygiene，San Antonio，Texas，1985,71 ～1147.
　　［2］The American Committee on Arthropod-Borne Viruses. 2000 Annual Report on the Catalogue of Arthropod- Borne and Selected Vertebrate Viruses of the World.2002［C］, January 31.
　　［3］Solomon T.Recent advances in Japnese encephalitis［J］. J Neroviro, 2003, 9:274～283.
　　［4］Chambers T J, Nestorowicz A, Mason PW,et al. Yellow fever/Japanese encephalitis chimeric viruses: construction and biological properties［J］.J Virol，1999,73(4): 3095～3101. 
　　［5］Ni H,Burns NJ,Chang GJ,et al.Comparison of nucleotide and deduced amino acid sequences of the 5’ non-coding region and structural protein genes of the wild-type Japanese encephalitis virus strain SA14 and its attenuated vaccine derivatives［J］. J Gen Virol,1994,75(pt6):1505～1510.
　　［6］Ni H, Chang GJ,Xie H et al.Molecular basis of attenuation of neurovirulence of wild-type Japanese encephalitis virus strain SA14［J］. J Gen Virol,1995, 76(pt2):409～413.
　　［7］Sumiyoshi H,Tignor GH,Shope RE,et al. Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA［J］. J Infect Dis,1995,171(5):1144～1151.
　　［8］Monath T P, Soike K I,Levenbook,et al. Recombinant, chimeric live, attenuated vaccine (ChimeriVaxTM ) incorporating the envelope genes of Japanese encephalitis (SA14-14-2) virus and the capsid and nonstructural genes of yellow fever (17D) virus is safe, immunogenic and protective in non-human primates［J］. Vaccine, 1999, 17: 1869～1882.
　　［9］Chen CJ， Chen JH，Chen SY,et al. Upregulation of rantes gene expression in neuroglia by Japanese encephalitis virus infection［J］. J Virol, 2004,78(22): 12107～12119.
　　［10］李玉华,胁田隆,保井孝太郎.流行性乙脑炎病毒E蛋白上基酸［J］. 中国生物制品学杂志，2002，15（1）:5～8.
　　［11］李晓宇,梁国栋.乙型脑炎病毒毒力基因定位的研究进展［J］.中国病毒学，2003，6，19（2）：187～190.
　　［12］Chen WR, Tesh RB, Rico-Hesse R. Genetic variation of Japanes encephalitis virus in nature［J］.J Gen Virol,1990,71(Pt12):2915～2922.
　　［13］Chen WR, Rico-Hesse R,Tesh RB. A new genotype of Japanes encephalitis virus from Indonesia［J］. Am J Trop Med Hyg,1992,47(1):61～69.
　　［14］Solomon T, Ni H, Beasley DWC, et al. Originan evolution of Japanese encephalitis virus in South east Asian［J］.2003,77：3091～3098.
　　［15］Phan TN, Marial CP, Vuong DC, et al. Shift in Japanes encephalitis virus (JEV) genotype circulating in northern Vietnam implication for frequent introductions of JEV from Southeast Asia to East Asia［J］. J Gen Virol, 2004,85:1625～1631.
　　［16］王环宇，付士红，李晓宇，等.我国首次分离到基因型Ⅰ乙型脑炎病毒［J］.中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(11):843～849.
　　［17］David T, Wang LF, Peter W. Molecular characterization of the first Australian isolation of Japanese encephalitis virus, the FU strain［J］. J Gen Virol 2000, 81:2471～2480.
　　［18］王环宇,潘晓玲,付士红,等.我国新分离乙脑病毒 02276 株的全基因序列特征［J］.中华实验和临床病毒学杂志,2006,9，20，（3）：203～208.
　　［19］李晓宇,宋宏,付士红,等. 中国流行性乙型脑炎病毒分子生物学特性研究［J］.病毒学报,2004,20(3):2000～209.
　　［20］Wang HY,Takasaki T,Fu SH,et al. Molecular epidemiological analysis of Japanese encephalitis virus in China［J］. J Gen Virol,2007,88:885～894.
　　［21］孙肖红，付士红，张海林，等. 云南省虫媒病毒的分离鉴定［J］.中华实验和临床病毒学杂志,2005，19（4）：319～324.
　　［22］Jan LR，Yueh YY，Wu YC，et al. Genetic variation of Japanese encephalitis virus in Taiwan［J］.Am J Trop Med Hyg,2000,62(4):446～452.
　　［23］Konishi E，Shoda M，Ajiro N，et al.Development and evaluation of an Enzyme-linked immunosorbent assay for quantifying antibodies to Japanese encephalitis virus nonstructural 1 protein to detect subclinical infections in vaccinated horses［J］. J Clin Microbiol，2004,42(11): 5087～5093.
　　［24］Parida MM，Santhosh SR，Dash PK，et al. Development and evaluation of reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and real-time detection of Japanese encephalitis virus［J］. J Clin Microbiol, 2006,44(11): 4172～4178.
　　［25］俞永新. 流行性乙型脑炎减毒活疫苗（SA14-14-2）弱毒株的表型和基因型特性及其稳定性［J］. 中国计划免疫，2002，8（5）：283～287.
　　［26］俞永新. 流行性乙型脑炎减毒活疫苗的发展和应用［J］. 上海预防医学杂志, 2006, 18(3): 110～112.
　　［27］章域震，张海林，俞永新，等. 三带喙库蚊和致倦库蚊经口感染乙型脑炎病毒疫苗SA14-14-2株的研究［J］. 中国人兽共患病杂志，2005，21（7）：584～586.
　　［28］章域震，张海林，俞永新，等. 三带喙库蚊和致倦库蚊胸腔接种乙型脑炎病毒减毒活疫苗SA14-14-2株的研究［J］. 中华实验和临床病毒学杂志，2005，19（4）：344～346.
　　［29］冯云，张海林，俞永新，等. 三带喙库蚊胸腔接种乙型脑炎病毒减毒活疫苗的感染动态及致病力观察［J］. 中国人兽共患病学报，2007，23（3）：278～281.
　　［30］刘志文，俞永新，张海林，等. 乙型脑炎减毒活疫苗病毒SA14-14-2株经三带喙库蚊胸腔接种后的生物学和分子生物学特性［J］. 中国生物制品学杂志,2007，20（6）：419～421.
　　［31］Tsai TF. New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination:minutes of a WHO/CVI meeting,Bangkok,Thailand,13～15 October 1998［J］. Vccine,2000,18(Suppl 2):1～25.

　　［32］Nam JH, Cha SL, Cho HW. Immunogenicity of a recombinant MVA and a DNA vaccine for Japanese encephalitis Virus in swine［J］.Microbiol Immunol,2002, 46(1):23～28.
　　［33］Ashok MS,Rangarajan PN. Immunization with plasmid DNA encoding the envelope glycoproyein of Japanese encephalitis Virus confers significant protection against intracerebral viral challenge without inducing detectable antiviral antibodies［J］. Vccine,1999,18(1-2):68～75.
　　［34］apanese encephalitis virus envelope protein fused to tissue plasminogen activator signal sequences:studies in a murine intracerebral virus challenge model［J］. Vccine, 2002,20(11-12):1563～1570.
　　［35］Konishi E,Yamaoka M,Kurane I,et al. Japanese encephalitis DNA vaccine candidates expressing premembrane and envelopegenes induce virus specifiec memory B cell and long-lasting antibodies in swine［J］. Virology,2000,268(1):49～55.
　　［36］Kaur R,Sachdeva G,Vrati S. Plasmid DAN immunization against Japanese encephalitis virus: immunogenicity of membrane anchored and secretory envelope protein［J］. J Infect Dis,2002,185(1):1～12.
　　［37］Kojima A, Yasuda A, Asanuma H,et al.Stable High-Producer Cell Clone Expressing Virus-Like Particles of the Japanese Encephalitis Virus E Protein for a Second-Generation Subunit Vaccine［J］.（akojima/at/nih.go.jp）.
　　［38］Lin YL,Chen LK,Liao CL,et al. DNA immunogenicity with Japanese encephalitis virus nonstructural protein NS1 elicits protective immunity in mice［J］.J Virol, 1998,72(1):191～200.
　　［39］Konishi E,Win KS, Kurane I,et al.Particulate vaccine candidate for Japanese encephalitis induces long-lasting virus-specific memory T lymphocytes in mice［J］. Vaccine,1997,15(3):281～286.