【名 称】                                                                   

中文名：肠道病毒71型(EV71)核酸扩增检测试剂盒

英文名：human enterovirus type 71 (EV71) Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction (PCR) Diagnostic Kit

汉语拼音: chang dao bing du 71 xing  he suan kuo zeng jian ce shi ji he 

【目的】

本试剂盒适用于检测疑似患者粪便、咽拭子标本、疱疹液或脑脊液等标本中肠道病毒71型(EV71)mRNA，适用于肠道病毒71型感染引起的手足口病的辅助诊断。其检测结果仅供参考。

【原理】

本试剂盒用Trizol提取肠道病毒71型(EV71)mRNA，经过逆转录作用生成cDNA，用一对肠道病毒71型(EV71)特异性引物结合一条特异性荧光探针，配以FQ-Buffer(内含Mg²⁺、Tris-HCl等)、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过一步PCR-荧光探针体外扩增法对肠道病毒71型(EV71) RNA进行扩增，从而达到快速实时定量检测之目的。 

【组成】

名      称	数      量	规      格
EV71 PCR MIX	1    管	800μl/管
酶反应系	1    管	80μl/管
EV71阳性质控品	1    管	100μl/管(1×107Copies/ml)
阴性质控品	1    管	250μl/管
DEPC水	1    管	2000μl/管

备注：Trizol等另行配备

【标本采集】

1. 适用标本类型：疑似病人粪便、咽拭子标本、疱疹液、脑脊液或病毒分离培养物标本等

2. 标本采集：  

咽拭子标本：采集病人发病3日内的咽拭子标本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3~5ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密闭送检。

疱疹液：用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3~5ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。

脑脊液标本：出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0~2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中。密闭送检测。

粪便：用灭菌捻拭子拭取粪便或腹泻物置入无菌玻璃管（含0.4ml 灭菌生理盐水），用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。

【保存和运输】上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶，采集标本应立即（12h内）送达实验室。

【适用仪器】主要包括ABI GeneAmp PCR System7700、ABI GeneAmp PCR System7500, ABI PRISM 7300, LightCycler等，LightCycler等毛细管的仪器，MJ Opticon系列或取得资格认证的定量PCR仪。

【使用方法】

1．RNA提取

1.1样品处理

取50ul样品(或阴性质控品)加入150 ul Trizol reagents（RNA提取液）充分震荡，室温放置10min。

1.2.加入100ul氯仿，用力震荡15s，室温静置5min， 4℃ 12,000rpm离心10min。

1.3.小心将上层水相转移到干净离心管中，加等体积异丙醇，充分混匀，12,000rpm离心10min。

1.4.弃上清，加入500 ul 75%的DEPC乙醇，充分混匀，12,000rpm离心10min，小心吸去大部分乙醇。

1.5.将提取管敞口在室温空气中干燥5min待乙醇挥发干净，用20µl DEPC H₂O溶解沉淀。

EV71阳性质控品：直接取3μl进行PCR扩增。 

2．PCR扩增

从试剂盒中取出EV71 -PCR MIX、酶反应系，室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。

设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净0.2ml离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入22μl，向每管中加入处理后样品(提取RNA)或EV71 -阳性质控品和阴性质控品3μl，10,000rpm瞬时离心10秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品，阳性质控品以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团种类(报告基团FAM、猝灭基团TAMRA)和循环条件:

ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700,ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反应盖)，ABI PRISM7300/7500(使用8联管)，MJ Opticon(使用8联管)等使用薄壁管的仪器:循环条件: 30℃→5min，42℃→45分钟，后93℃→2分钟，后93℃ 30秒→55℃ 45秒， 40个循环。

LightCycler等使用毛细管的仪器: 循环条件: 30℃→5min，42℃→45分钟，93℃→2分钟，后93℃ 5秒→58℃ 45秒，共40个循环。

3. 结果分析判定

Ct 值小于37个循环的为阳性；Ct 值在37-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct 值仍然在37-40个循环之间，判断为阳性，没有荧光值增长为阴性(<5×10²Copies)。

【质控标准】

阴性质控品：全部阴性

EV71 -阳性标准品：阳性对照的 Ct 值均应小于 30.0，且呈标准S型扩增曲线。

以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。

【注意事项】

初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书操作进行。

所有使用的离心管应高压灭菌(推荐使用，而且必须不含RNA酶。

PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。

试剂盒里不同组分不能混用。每盒试剂请于3 次内使用完毕。

所有试剂及待检标本应看作是传染物质。

【规格】40份/盒。

【贮藏及有效期】试剂盒应-20℃闭光保存，避免反复冻融。有效期10个月.