呼吸道合胞病IgM检测试剂盒（酶联免疫法）

1、实验原理

此酶免试剂盒可用于人血清中抗RSV（呼吸道合胞病毒）IgM抗体的体外定性和定量检测。

2、前言说明

在患有细支气管炎或肺炎的六个月大的婴儿中，可发现呼吸道RSV感染和特定的临床症状之间有明显的联系。在年龄稍大 的婴儿和小儿中，感染症状会温和一些。 25%以上的RSV呼吸道感染都是可被察觉的。由于RSV再次感染的可能性，人们认为这些再次感染的抗体与成年人中这些疾病的缓慢发展过程（类似于感冒） 有关。然而，特别是早年，血清抗体并不能成为抗呼吸道感染的有效保护。因此，这种病原体可能会引起细支气管炎或引起四岁大的婴儿患肺炎。基于呼吸道合胞病 毒抗原的关系，我们可以将呼吸道合胞病毒分为两大类（A和B）。病毒的表面糖蛋白（G糖蛋白和融合糖蛋白）可产生病毒抑制抗体。RSV的A和B类病毒的G 糖蛋白与F糖蛋白相比明显不同。用于RSV血清学诊断的补体结合实验，其结果不是很理想。用于RSV感染的血清学诊断的酶免检测具有很高的诊断价值，因为 酶免检测灵敏度很高，并且可区分不同抗原的免疫球蛋白。在RSV感染中，IgM抗体反应可能不会出现或很弱，以至于不能获得可靠的实验结果。在一急性感染 中，因为IgA抗体可能会持续几个月或几年，所以单一样品中的IgG抗体检测并不明显。被推荐为急性RSV感染血清学检测方法是检测血清中的IgG抗体 （双份，要求其浓度明显提高了）。

3、实验原理

此固相ELISA试剂盒利用的夹心法原理。包被板上包被了抗原。用对人IgM具有特异性的酶标二抗来检测结合到包被抗原的样品特异性抗体。底物反应后，所显示的颜色强度与检测到的IgM特异性抗体的量成正比。样品的结果可直接使用标准曲线得。

4、试剂盒组成：

4×2ml	标准品A-D	1；10；50；150U/mL，待用 标准品A=阴性质控           标准品B=临界质控 标准品C=弱阳性质控         标准品D=阳性质控 内含抗RSV的IgM抗体，PBS（磷酸缓冲液），稳定剂。
1×14ml	酶标IgM	红色，待用。内含过氧酶标记的抗人IgM，蛋白缓冲液，稳定剂。
1×12×8	包被板	可拆，包被有特异性抗原。
1×14ml	TMB底物液	含TMB
1×14ml	TMB终止液	0.5M的H2SO4
1×60ml	稀释液	含PBS缓冲液，＜0.1%NaN3
1×60ml	浓缩洗涤液	浓缩型（10×），含PBS缓冲液，吐温20
2×	粘性金属板	用于在温育时遮盖包被板
1×	塑料袋	用于储存不用的板条

5、实验所需材料但试剂盒不提供

1)        RF吸附剂

2)        移液器，体积：5；50；100；500 µL

3)        校准仪

4)        样品稀释用试管（1ml）

5)        带试剂储器8道移液器

6)        洗涤瓶，自动或半自动洗板机

7)        能在450nm处读数的酶标仪

8)        双蒸水或去离子水

9)        吸水纸，取样吸头和计时器

6、实验前的准备说明

6.1成分准备

稀释/溶解	成分		稀释液	比例	备注	贮存	稳定性
60ml	洗涤液	加600ml	双蒸水	1：10	加热至37°C以溶解 结晶，充分混合	2-8°C	8周

6.2样品稀释

样品	稀释	稀释液	比例	备注
血清/血浆	全部稀释	稀释缓冲液	1：101	例：5µL+500µL

样品中IgM浓度高于最高标准品的应当进一步稀释。

6.3用RF吸附剂处理：

注意	为了避免特异性IgG和类风湿因子的干扰，病人的血清应当用RF吸附剂处理(RE59059)。 标准品和质控品千万不要用RF吸附剂处理。
1.	在400µL按1：101的比例稀释的样品中加入20µL RF吸附剂。充分混合。
2.	室温（18-25℃）下温育≥1min（﹤15min）

为了避免吸附特异性抗体，应当避免温育时间﹥15min。

预处理的样品可能会是浑浊的。

7、实验步骤：

1)        加100µL标准品和已稀释样本于相应反应孔中，在定性检测中只使用标准品B。

2)        封板后室温（18℃-25℃）温育60分钟。

3)        移去粘性金属板，弃去孔中液体。用300µL洗涤液洗板3次，在吸水纸上拍干。

4)        在每一微孔中加入100µL酶联物。

5)        封板后室温（18℃-25℃）温育30分钟。

6)        移去粘性金属板，弃去孔中液体。用300µL洗涤液洗板3次，在吸水纸上拍干。加底物液和终止液时，如果有条件的话，可使用8孔微量移液器。确保底物液和终止液都是相同的时间间隔加入。使用确切容积并避免气泡产生。

7)        每孔加TMB底物液100µL。

8)        室温（18℃-25℃）避光温育20分钟。

9)        在每一微孔中加入100µLTMB终止液以终止底物反应。轻轻摇动包被板以使试剂混合均匀。此时，颜色蓝色变成黄色。

10)     加终止液后60分钟内在450nm处测OD值。

8、结果计算

在半对数坐标纸上或用自动生成的方法，以标准品的OD值为Y轴，浓度为X轴，绘制一标准曲线图。用立体图、4参数对 数图或对数-对数图都可获得良好的实验结果。对于标准曲线图，用标准品的每一单值进行计算（样品结果明显异常的值必须删除掉，应使用更加合理的单值）。样 品的浓度可直接从标准曲线上获得。一旦样品稀释了，就应当乘以相应的稀释因子。如果样品所测得的浓度高于最高标准，则应根据实验前的准备说明所述对样品进 行稀释，并重新检测。

9、结果判定： ＞12 U/ml  为阳性,8 - 12 U/ml  为可疑,＜ 8 U/ml  为阴性

此检测结果并不是任何治疗结果判定的唯一因素，它应当结合临床观察和诊断结果加以判断。

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