一、如何检测瘦肉精？

    目前，检测瘦肉精的方法主要有四种，即高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、毛细管区带电泳法(CE)和免疫分析技术(IA)。而我国结合自己的实际情况，2001年农业部首先组织制定了饲料中盐酸克伦特罗的测定标淮。该标准选择确定了两种：即高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)。其中将HPLC法作为检测瘦肉精的半确证性方法，其最低检测限为0.05μg/ kg，优点是检测精确度高，而且假阳性率低；缺点是检测过程烦琐、检测时间长，需贵重仪器、难于操作、价格昂贵。而GC-MS法优点是能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析。GC-MS法与HPLC法相比，检测灵敏度更高，假阳性率更低，已将GC-MS法定为检测瘦肉精的确证性方法。GC-MS法的缺点同HPLC相似。

    目前，英国的Randox Laboratories litd和德国的R-biopharm公司均开发出了检测肉品、饲料中瘦肉精的ELISA试剂盒。

二、瘦肉精检测所需试剂和试纸

　　(1)试剂和材料  以下所有试剂，除特别注明外，均为分析纯试剂；水为符合GB／T6682规定的二级水。
    ①盐酸克伦特罗对照品：含盐酸克伦特罗不得少于98．5％
    ②盐酸
    ③无水甲醇
    ④氢氧化钠
    ⑤磷酸二氢钾
    ⑥磷酸
    ⑦盐酸溶液  取盐酸4．2ml，加水至1000ml，即得。
    ⑧o．5mol／L磷酸二氢钾溶液  取磷酸二氢钾68g，加水800ml溶解并用磷酸调pH值至3．O，用水稀释至1000ml，即得。
    ⑨0．05mol几磷酸二氢钾溶液  取磷酸二氢钾6．88，加水800ml溶解并用磷酸调pH值至3．0，用水稀释至1000mi，即得。
    a．氢氧化钠溶液  取氢氧化钠48，加水使溶解成100mi，即得。
    b．盐酸克伦特罗对照品储备液(1mg／mi)  准确称取28．3mg盐酸克伦特罗对照晶至25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至25ml，一20~C以下保存，有效期1年。
    ⑩盐酸克伦特罗对照品工作液(10ttg／mi)  取lmg／mi储备液o．5ml到50mi量瓶中，加水至50mi，2～8~C保存，有效期1个月。
    ⑾盐酸克伦特罗对照溶液(100ng／m1)  取1(ug／m1工作液o．5ml到：50mi量瓶中水至50mi，2～8~C保存，有效期1个月。
    ⑿盐酸克伦特罗检测试剂盒(2～8~C冰箱中保存)
    ⒀固相萃取柱C，s：100mglml含碳量≥17％

    (2)仪器和设备

STI500高效液相色谱仪

VI2010智能色谱软件

UV501可变光紫外检测器

安捷伦1100二极管阵列检测器

8725i手动进样阀、VI-11手动进样阀

VertexC18 4.6*250,5um高性能液相色谱柱
    ①酶联免疫反应读数仪
    ②分析天平  精度0．00001g
    ③天平  精度0．01g
    ④冷冻离心机
    ⑤50mi具塞离心管
    ⑥匀浆机
    ⑦微型振荡器
    ⑧回旋振荡器
    ⑨微量移液器  单道20uL，50ul，100uL；多道50～250uL，
    ⑩干热浓缩器
    ①空气压缩机

    (3)测定步骤
    ①试料的制备(尿)
    取供试尿lml，于3000r／min离心l0min，上清液作为供试试料，直接供酶联免疫测定法测定。
    取空白尿lml，于3000r／min离心l0min，上清液作为空白试料，直接供酶联免疫测定法测定。
    取空白尿2ml，于3000r／min离心l0min，上清液1.0ml添加l00ug／L的克伦特罗对照溶液20／H。作为2ug/l空白添加试料，直接供酶联免疫测定法测定。
    ②试料的制备(肝)
    取约l00g新鲜或冷冻后融化的空白或供试猪肝,用匀浆机以10000r／rain匀浆1-2min，使均匀呈糊状，一20~C以下冰箱中贮存备用。
    取均浆后的供试肝样，作为供试试料。
    取均浆后的空白肝样，作为空白试料。
    取均浆后的空白肝样(1土0．05)e添加l00ng／m1的克伦特罗对照溶液20tzL作为2ng／g空白添加试料。
    a：提取(肝)  取(1士o．05)z试料，置50ml离心管中；加盐酸溶液5.0mi，旋涡混匀，中速振荡1．5h；在10—15~C下以4000r／mill以上速度离心15min；上清液移人另一50ml离心管中，加入氢氧化钠溶液300gL，混匀，振荡15min；加0.5mol／l磷酸二氢钾溶液4。0ml，混匀，2—8~C放置过夜；取上述溶液于10～15~C以4000r／111113以上的速度离心15min，上清液备用。
    b．净化(肝)  C，，固相萃取柱依次用无水甲醇3mi、0.05mol／L磷酸二氢钾溶液2mi预洗，不使柱床干涸；将备用上清液全部过柱；用0.05mol／L磷酸二氢钾溶液2ml淋洗，挤干，弃去所有淋洗液；用无水甲醇2mi洗脱，流速控制在0.5ml／mm以下，挤干，收集洗脱液；于50～60~C下用氮气或空气缓缓吹干洗脱液；残余物用水1.0ml溶解，以4000r／mill以上的速度离心15rain，清液作为试样溶液供酶联免疫测定法测定。
    ③测定
    a．室温应控制在19～30~C。
    b．取在19—30~C放置1—2h的试剂盒，按每个标准溶液和试样溶液至少两孔计算所需酶联板条的数量，插入框架。每个微孔加入用缓冲溶液100倍稀释的抗体100~tL，封口膜封板，室温孵育30min。
    c倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体。用多道移液器加水250pL到酶联板的微?L内，稍后倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，如此重复操作洗板3次。
    d．分别吸取标准溶液、空白试料、空白添加试料和供试试料各20uL，分别放入不同微孔底中央，并在每孔内加入用缓冲溶液100倍稀释的酶结合物100~I。，在微型振荡器上混匀，用封口膜封好，室温孵育30min。
    e．倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体，重复洗板3次。
    f．用多道移液器加入用底物缓冲溶液10倍稀释的底物100uL，室温避光孵育15min。
    g．用多道移液器每孔加终止液100uL。
    h．在1h内将酶联板放于酶标仪内，于450nm波长处测定吸光度值。

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    (4)计算  用数据分析软件对结果进行分析，绘出标准曲线，并得出试料中克伦特罗的含量。

    (5)灵敏度和回收率
    本方法的平均检测下限为0.1mg／Kg。

    本方法在1ug／kg添加浓度水平上猪尿回收率范围为60％一120％，猪肝回收率范围为40％～120％。

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