1  病毒的分离鉴定

    无菌采集病料经处理后接种9～11日龄鸡胚，收取尿囊液测定血凝活性，若为阴性则应继续盲传2－3代。对具有血凝活性的尿囊液需先用新城疫（ND）抗血清做血凝抑制（HI）试验，以排除ND感染。然后用免疫扩散等方法来检测特异性核心抗原——核糖蛋白（NP）或基质蛋白（MP），再用血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验鉴定A型流感病毒亚型。分离鉴定的同时，进行致病力试验，确定毒力强弱。

病毒的分离鉴定对禽流感的诊断比较确实，但操作程序繁琐，费用多，耗时费力。

2  血清学诊断技术

2．1    琼脂扩散（AGP）试验进行病毒抗原型特异性鉴定

    即用已知阳性血清和未知抗原进行AGP试验。受检样品是具有血凝素活性的鸡胚尿囊液。AGP是用来检测A型流感病毒群特异性血清抗体，即抗核糖蛋白（KNP）基质蛋白（MP）抗体，因而适用于鉴定流感病毒。1979年Beard首次将AGP用于食流感抗体的检测。

此法虽然简单易行，但是敏感性较差，易出现假阳性。AGP最常用的是免疫双扩散，陈海燕分别开展了禽流感病毒快速定型双扩散法的研究，不仅提高了其敏感度，且快速省时，在此方法基础上建立的AGP诊断技术及其诊断试剂盒，在全国范围内得到推广应用，并取得良好的效果。

2.2 血凝(HA)血凝抑制试验（HI）

    一般情况下，新分离毒株要先鉴定出特异性NP或MP抗原型（用AGP）确定禽流感病毒，再做HA亚型的鉴定。

    现已有人采用改进HA试验方法，称为HA加敏法。该法测抗体效价比常规法高2－4倍，若抗原用乙醚裂解，其敏感性比常规法高4～6倍，但观察时以30分钟内为好，否则易出现假阳性。另外，还应注意在HI试验时，应先除去非特异性凝集反应。许多禽类血清都含有非特异性因子，能和红细胞表面受体竞争性地作用于病毒表面的血凝素而发生非特异性凝集反应。通常用广州健仑生物科技有限公司供应的受体破坏酶（RDE）即霍乱菌培养液处理法或高碘酸钠法制备血清。

HA、HI特异性好，是亚型鉴定的常用方法，但其操作过程繁琐费时，并且由于用已知HA亚型的抗血清不能检出新的HA亚型的禽流感病毒，所以用该方法鉴定不如琼脂扩散实验简便和快捷。

2．3  神经氨酸酶抑制试验（NIT）

    根据A型流感病毒的表面抗原特性，特别是血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）特性，不仅可通过HI试验对病毒进行鉴定，而且可通过NI试验进行鉴定。1983年R.A.Van．Deusen介绍了NI试验的一种改进法——平板微量NI试验，此法虽不能提供常量法的定量，但却是A型流感病毒的病毒分类和抗体检测的快捷方法。试验证明，微量NI试验能对分离物做出准确鉴定，而常量NI试验检测亚型混合物更敏感。

    目前国立兽医实验所已将微量NI试验列为流感病毒分离物定型及筛选畜禽血清9型NA抗体的常规方法。诊断中也已广泛采用此法，特别是美国在80年代火鸡发生流感病毒期间，各次流行所得的血清样本用微量NI试验所作出的A型流感病毒亚型鉴定结果已被病毒分离、疫苗接种和流行病学资料所证实。这种方法已被证明是快速的，且成本较低和有可重复性。这种技术的可靠性将导致NI试验的广泛应用。

2．4  中和试验（NT）

以中和试验（NT）来鉴定或满定流感病毒时，常用鸡胚或组织培养细胞，操作方法与其他病毒（如NDV）的中和试验相同。

NT试验是最敏感而特异的血清学方法，只有抗体与病毒颗粒上的表面抗原相对应，特别是与吸附到宿主细胞上的病毒表面抗原相对应，才能在实验中取得满意的显示效果。因此，某一个血清型的中和实验机体只与同组内的其他病原表现出有限的交叉反应。

    病毒中和实验操作繁琐耗时费料，临床上几乎不用。但作为经典方法在病毒鉴定中起着重要作用，许多新的检测方法都要以此作为标准进行比较。

2.5  免疫荧光技术（IFT）

    免疫荧光技术就是荧光抗体技术（FAT）。IFT早在1961年就开始用于人类流感的快速诊断。1984年美国宾西法尼亚州爆发禽流感时Skeeles将IFT首次用于AIV的检测。IFT最早用于病毒的鉴定和定位病毒感染细胞中特异性抗原，主要是核内荧光；用MP抗原的荧光抗体主要出现胞质荧光，核内也有部分荧光。

    用于禽流感病毒的诊断常用直接荧光抗体法，即在组织触片上直接染色，以荧光显微镜检查荧光，一种AIV的荧光抗体可用来检测不同亚型的其他病毒。

    IFT用于诊断具有快速、简便、敏感性好的特点，而且费用较低。其敏感度同病毒的分离鉴定相当，有时高于用鸡胚进行的病毒分离。但是需要注意的是如何避免和降低标本中出现的假阳性问特异性荧光）问题。

    对一株杂交瘤细胞分泌的流感病毒的单克隆抗体进行检测时，发现间接固相免疫荧光技术的敏感性比HI高 40－150倍。间接免疫荧光技术也可以用来检测核蛋白（NP）基质蛋白（MP）抗原与抗体的反应，其敏感性很高。但对抗原制备要求较高，需用非离子型去污剂对纯化的病毒粒子进行裂解。

2．6   酶联免疫吸附法（ELISA）

    1974年Jenning等首先用ELISA对注射流感病毒所产生的抗体消长规律进行了检测，Lanbre认为ELISA的敏感性远高于HI补体结合反应。Meulemans（1987）对ELISA．AGP，HI检测AIV抗体 进行了比较研究，发现 AGP和  ELISA一样均能检测型特异性抗原（抗体），但敏感性远低于ELISA，HI适用于亚型的检测，其敏感性不如ELISA。1993年，Shodihall用混合纤维素脂膜或硝酸纤维素膜代替微量反应板，建立了快速诊断的DAS～ELISA，大大缩短了诊断时间，并可保留ELISA的特异性、敏感性，其结果又不需要特殊仪器分析，可用肉眼判定。

    随着分子生物学技术的发展，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的李海燕等用表达禽流感病毒核蛋白的杆状病毒感染S。昆虫细胞，以其表达产物制备抗原，建立了以杆状病毒系统表达的AIV核蛋白为抗原的禽流感间接（重组核蛋白）ELISA诊断技术（rNP－ELISA，确定了其最适工作条件，并对3 138份鸡血清进行了检测，实验证明，rNP－ELISA与全病毒间接ELISA（AIV－ELISA），AGP及HI的符合率分别为99.9％，97.1％，98.8％;并能100％检出AGP阳性及疑似HI阳性的血清样品，这证明了rNP－ELISA是检测A型禽流感病毒血清特异性抗体的一种特异、敏感、微量。快捷、经济的血清学诊断技术。

ELISA方法的敏感性和特异性与抗原的纯度直接相关。1984年Abraham等报道了抗原快速提纯法，所需时间比常规法缩短10倍，并且研究结果表明应用提纯抗原几乎全部排除了假阳性反应。

目前美国Kiregard Reery和Labortories有试剂盒出售。ELISA成为AI流行病学普查及早期快速诊断的最有效和最实用的方法。

3  分子生物学技术

3.1  聚合酶链反应（PCR）及反转录一聚合酶链反应（RT——PCR）

    PCR是近来发展成熟起来的一种体外基因扩增技术，能在数小时内使DNA呈指数增加，已成功地用于多种病毒的基因检测和分子流行病学调查等。其检测原理为：寻找传染性因子的特异DNA序列，对待测样品进行PCK扩增。如果检测出了相应的扩增带，则判为阳性反应；反之，无扩增带则为阴性反应。

鉴于引起致病的禽流感病毒多是H5和H7血清亚型，在PCR技术的基础上，崔尚金等（1998）建立了一种直接检测禽粪样和鸡胚尿囊液中AIV已亚型RNA的RT－PCR反应，并将此法与AGP和电镜技术作了比较，结果表明引物的特异性决定了产物的特异性，并且该方法灵敏度高，检测过程仅需到。时左右，并且大大缩短了感染后的检出时间。

    应用毛细管PCR（15分钟30个循环）代替常规PCR（2．5个小时30个循环）以进一步缩短检测时间的研究也已展开并进入更深入的领域，以期用于不同样品（组织、组织液、分泌液、粪便等）的检测，区分高致病力毒株和低致病力毒株与非致病力毒株，从而深入探讨该方法在AIV的临床早期诊断，流行病学调查及发病机制中的应用价值，为我国AIV的综合防治措施做出贡献。

3．2  核酸探针技术

    核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究应用最广泛的技术之一，是定性和定量检测特异性DNA或RNA的有力工具。

    核酸探针技术的原理：在进行杂交时，用一种预先分离纯化的已知DNA或RNA序列片段去检测未知的核酸样品，对作检测用的已知DNA或RNA序列片段加以标记的片段就称为核酸探针。作为核酸探针的DNA或RNA是各种病原微生物基因的一部分。在变性分开的待检DNA或RNA单链中加入与其有互补作用的核酸探针。探针在一定条件下就能与原来变性分开的DNA或RNA单链上的互补区段形成氢键，从而结合成杂交双链，通过洗涤，除去末杂交上的标记物，然后进行放射自显影，即可确定原待检样品有无与探针互补的DNA或ILNA序列。

    Bashiruddin等（1991）报道了扩增HA基因来分析致病毒株与非致病毒株的差异，证实了致病毒株与非致病毒株氨基酸的差异，显示了本方法的应用前景。

3．3   荧光PCR法

    利用生物学手段，用荧光PCR方法快速检测禽流感病毒的方法已在北京通过专家鉴定，这一研究成果不仅在国内属于首次，而且在国际上也属于先进水平。它与国际标准方法鸡胚病毒分离相比，不仅无需做鸡胚病毒分离培养，而且时间也由原来最短的21天缩短为4小时。

4    电镜技术

    由于流感病毒为正粘病毒，属于形态特征性强的病毒，因而可用电镜技术来诊断，为提高禽流感的检出率，除样品制备技术外，取病料的部位和时间也是获得准确检验结果的关键。病料的采集部位及取材时间应根据禽流感病毒在动物体内的分布特征及其感染特性而定。

5    展    望

    在以上各种检测方法及科学技术发展的基础上，将PCR技术与ELISA技术结合起来，建立一种新的实验室检测AIV的方法，将有较大的研究价值。其实验原理（以此类方法中最简单的双引物双标记法为例）如下：

    PCR的一对引物中，其中一种引物用生物素标记，另一种引物用地高辛标记，酶标微孔板上用生物素的亲和素包被（生物素的亲和素与生物素特异的结合）。PCR扩增后经纯化去除引物、dNTP、引物二聚体等小分子后，将PCR扩增后纯化片段加入微孔板中。此时，微孔板上包被的生物素亲和素将与引物上的生物素结合而捕捉了PCR片段，再在微孔板中加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，该抗体将与另一引物上的地高辛结合，从而形成生物素亲和素一生物素一PCR片段一地高辛一抗地高辛一酶的复合物。加入酶的相应底物进行显色，便可判断PCR扩增的有无。由于该方法是PCR技术和ELISA技术的结合，所以它是一种两级放大系统，即PCR放大和ELISA放大，故而它的灵敏度更高。同时这种方法避免了PCR产物分析时的电极及染色过程，所以更为快捷、简便、灵敏。