登革热IgM 捕捉ELISA 法（MacELISA）实验
发布时间：2014-3-8 9:20:13 浏览次数：
登革热IgM 捕捉ELISA 法（MacELISA）实验
阳性抗原：采用C6/36 细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。
阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36 细胞为阴性抗原对照。
（2）抗人IgM（μ 链）单克隆抗体或多克隆抗体；
（3）登革病毒IgM 阳性、阴性对照血清；
（4）辣根过氧化物酶标记登革病毒单克隆抗体；
（5）缓冲液：
洗涤液：pH7.4 PBS－T（0.05％吐温－20）；
稀释液：pH7.4 PBS（5％牛血清）；
封闭液：pH9.6 碳酸缓冲液（1％牛血清白蛋白）；
（6）显色液：A/B 液
（7）终止液：4N H2SO4
（8）酶标板、酶标仪。
检测步骤：
（1）用稀释液按效价稀释抗人μ 链单克隆抗体，100μl/孔，加盖，4℃过
夜；
（2）弃去抗人μ 链，用洗涤液重复洗3 次，甩干，加封闭液，100μl/孔，
置37℃水浴孵育2 小时；
（3）弃封闭液，用洗涤液重复洗3 次，甩干。
（4）将待检血清用稀释液从1：10 开始作2 或4 倍连续稀释，加入酶标板
试验材料：
（1）抗原：阳性抗原：采用C6/36 细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。
阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36 细胞为阴性抗原对照。
（2）抗人IgM（μ 链）单克隆抗体或多克隆抗体；
（3）登革病毒IgM 阳性、阴性对照血清；
（4）辣根过氧化物酶标记登革病毒单克隆抗体；
（5）缓冲液：
洗涤液：pH7.4 PBS－T（0.05％吐温－20）；
稀释液：pH7.4 PBS（5％牛血清）；
封闭液：pH9.6 碳酸缓冲液（1％牛血清白蛋白）；
（6）显色液：A/B 液
（7）终止液：4N H2SO4
（8）酶标板、酶标仪。
检测步骤：
（1）用稀释液按效价稀释抗人μ 链单克隆抗体，100μl/孔，加盖，4℃过
夜；
（2）弃去抗人μ 链，用洗涤液重复洗3 次，甩干，加封闭液，100μl/孔，
置37℃水浴孵育2 小时；
（3）弃封闭液，用洗涤液重复洗3 次，甩干。
（4）将待检血清用稀释液从1：10 开始作2 或4 倍连续稀释，加入酶标板
孔中，100μl/孔，同时加入已1：10 稀释的阳性血清、阴性血清对照各4 孔,
100μl/孔，置37℃水浴孵育2 小时；
（5）弃去血清，用洗涤液重复洗3 次，甩干，分别加4 个型DV 抗原及阴性
抗原对照，100μl/孔，4℃过夜；
（6）弃抗原，用洗涤液重复洗3 次，甩干，加用稀释液稀释至工作浓度的
相应的登革热酶标单克隆抗体，正常抗原加4 个型混合的酶标单克隆抗体，
100μl/孔，37℃水浴2 小时；
（7）弃去标记物，用洗涤液重复洗3 次，甩干，于各反应孔内加A/B 液各一滴，37℃，避光3～5 分钟；
（8）加终止液于每反应孔，一滴/孔。
结果判断：
（1）目测方法：
阳性对照孔呈明显蓝色，阴性对照孔呈无色，对照成立；若待检血清孔呈明
显淡蓝色或深蓝色（TMB），则标本为登革热IgM 抗体阳性，反之阴性。
（2）酶联免疫检测仪检测：
于450nm（TMB）阳性对照孔OD 值/阴性对照孔OD 值，即P/N≥2.1，对照成
立；若待检血清孔OD 值与阴性对照孔OD 比值≥2.1，则标本为登革热IgM 抗体
阳性，反之阴性。（阴性对照孔OD 值小于0.05 按0.05 记，若大于0.05 按实际
数值计算）
意义：
阳性结果，表明患者新近DV 感染，用于登革热早期诊断。
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