一、菌落PCR法快速鉴定阳性克隆

1、菌落PCR引物的设计

    ①、为了最大程度避免菌落PCR出现假阳性结果，原则上应将引物的一端设计在载体上，另一端设计在插入片段上，长度25碱基足矣；

    ②、为减少非特异性片段的产生，同时保证两步法能够有效扩增出目的片段，建议将引物的Tm值设计在62-68℃之间；

注：Tm值的计算请采用“最邻近法”（the nearest neighbor method），该法计算准确度较高，为多种计算机软件所采用（需要相关软件的同学请到FTP上下载“Molecular.Biology.Insights.Oligo.v7.37.zip”）。金斯瑞引物合成单上的Tm值经验证完全不准，请无视之！

③、引物设计时请适当考虑通用性，如插入片段为RxR，则可将引物设计在DBD区，相比之下，对这一区域做缺失研究的人较少，载体以PGL3系列载体为例，可将引物设计在荧光素酶的基因序列上，保证对PGL3-Basic、Promoter和Enhancer均有效；

④、目的片段长度在500 bp以上较为合适，一方面可以检测两段引物之间的序列是否出现缺失或插入，另一方面跑胶时条带也比较明显（碱基数越多则结合的染料越多）。

 

2、菌落PCR步骤

①、牙签挑取单菌落后，浸泡于200 µL无抗LB培养基中，旋涡混匀5-10 s，使菌体在培养基中均匀分布；

注：挑选单菌落时请挑个头中等，不大不小的菌落，这样的菌落呈阳性的概率较高。一般情况下，含有空载体的菌生长较快，故菌落大，不宜挑取，菌落太小则无法区分是空载体菌落还是还有目的片段的菌落，亦不可取。此为经验之谈，具体原因不明。

②、吸取1 µL菌液作为模板，进行15 µL体系的两步法PCR（68℃延伸，98℃解链），剩余菌液4℃存放备用；

注：预变性（94℃）时间应延长至10 min，使菌体破裂。目标片段为1000 bp左右时，20循环已足够，若目标片段为500 bp左右，则建议进行25循环。菌液（尤其是DH5α）在接种前不可进行振荡培养，否则容易导致小摇失败（不长菌），经验之谈，原因不明。

③、PCR产物鉴定：方法一（推荐）：取PCR产物（10 µL左右），加Loading Buffer后跑胶鉴定，凡没有特异性条带或泳道中明显的条带不止1条的，均可判定为阴性菌落，弃之。方法二（不太推荐，赶时间的话可以试试）：在PCR产物（10 µL左右）中直接加入用TAE按1/10稀释后的“UltraPower”荧光染料1 µL，混匀后等待30 s，之后于365 nm紫外灯下观察颜色变化，溶液呈浓绿色的可认定为阳性菌落（即PCR能够扩增出产物，但是不是特异不好说，根据以往经验，该法产生假阳性的概率<10%）；

④、将阳性菌落所对应的菌液转接于20 mL含抗培养基中，培养15-16小时，保种后提取质粒（如有必要，可送测序）。

 

二、质粒的提取与内毒素的去除

1、小提试剂盒提取质粒

①、取菌液16 mL，平均分到4个离心管，离心后收集菌体，按小提试剂盒的说明书操作，提取质粒；

注：16 mL菌液裂解后，以两个吸附柱吸附即可（理论上可吸附80 µg质粒），使用更多的吸附柱不会提高回收率（经验）。另外，菌液多不代表质粒就提得多，16 mL与20 mL，在相同的裂解体系下，其质粒提取总量相差不会超过10%（经验）。因此，使用过多的菌液除了增加产物中内毒素的含量外，无实际意义。

②、最后一步洗脱时，建议每个吸附柱加洗脱液（水或TE）100 µL，洗脱一次后，再将洗脱液吸回吸附柱中，重复洗脱一次，一般情况下可提高洗脱率20%左右，同时建议暂时保留吸附柱，待检测质粒含量后再决定是否进行第三次重复洗脱。若菌体长势良好，该步骤可获得质粒约60-75 µg。

注：采用更多地洗脱液有助于提高回收率，但过大的溶液体积将导致后续步骤（异丙醇沉淀DNA）中质粒的损失，故建议洗脱液用量为每柱100-125 µL。

 

2、内毒素去除

①、取质粒溶液，加入0.125倍体积的3 mol/L乙酸钠溶液（pH5.0），置于冰上预冷5 min；

②、向预冷的溶液中添加0.125倍体积的去内毒素试剂（Endotoxin-Be-Gone），混匀后在冰上静置10 min；

③、将溶液转移到65℃水浴锅中，放置0.5-1 min，此时可见溶液变浑浊；

④、取出浑浊液于12000 rpm下离心2 min，转移上清液；

注：天冷时，③、④两步的间隔时间要短，动作要快，否则内毒素去除试剂将无法通过离心去除。此外，室温在25℃以上时，内毒素去除效果较好，步骤②-④做两次即可，室温较低时，应做三次，以保证内毒素去除率。

 

3、质粒回收

方法一（沉淀法）：

①、内毒素去除后，加入1倍体积的异丙醇，于12000 rpm离心20 min左右（可在室温下进行）或加入2倍体积的无水乙醇，于12000 rpm冷冻离心20 min左右，即可在离心管底部看见DNA沉淀；

②、若采用异丙醇沉淀，则用75%乙醇清洗沉淀2次（12000 rpm，离心5 min）除盐；若采用乙醇沉淀，则清洗1次足够；

③、弃去上清液，空干乙醇，溶解质粒。

 

方法二（吸附法）：

内毒素去除后，加入0.4倍体积的3 mol/L乙酸钠，取小提柱2根，将溶液均匀添加在吸附柱中，按试剂盒说明书回收质粒。

注：两种方法对质粒的回收效果没有显著区别（回收率为70%-85%），但相对来说异丙醇沉淀法对操作要求较高，且耗时较长，故建议使用吸附法。

  

广州健仑生物科技有限公司

徐华

2005/03/28