FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点

1、荧光试剂和探针经济、安全；

2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；

3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；

4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；

5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；

6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

　　FISH技术是一种非放射性分子遗传学实验技术，其基本原理是将直接与荧光素结合的寡聚核苷酸探针或采用间接法用生物素、地高辛等标记的寡聚核苷酸探针与变性后的染色体、细胞或组织中的核酸按照碱基互补配对原则进行杂交，经变性—退火—复性—洗涤后即可形成靶DNA 与核酸探针的杂交体，直接检测或通过免疫荧光系统检测，最后在荧光显微镜下显影，即可对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
　　FISH技术有以下几点优势：

① 安全、快速、灵敏度高；

② 探针能较长时间保存；

③ 多色标记，简单直观；

④ 可用于中期染色体及间期细胞的分析；

荧光原位杂交技术问世于70年代后期，其曾多用于染色体异常的研究，近年来随着FISH所应用的探针钟类的不断增多，特别是全Cosmid探针及染色体原位抑制杂交技术的出现，使FISH技术不仅在细胞遗传学方面，而且还广泛应用于肿瘤学研究，如基因诊断基因定位等 。原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每次检验均 需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外，由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数上的误差等。与之比FISH则具有：

①操作操作简便，探针标记后稳定，一次标记后可使用二年；

②方法敏感，能迅速得到结果；

③在同一标本上，可同时检测几种不同探针；

④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究，而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究等特点。

荧光原位杂交技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

FISH选用的标本可以是分裂期细胞染色体也可以是间期细胞．间期细胞可以是冰冻切片，也可以是细胞滴片或印片。生物素（Biotin），地高辛（digoxigenin），dinitrophenyl（DNP），aminoacetyl fluorine（AAF）等均可用于探针标记。前两者较为常用，通常采用切口平移法（Nick translation）或随机引物法（Random Primer）对探针标记。在已知探针DNA结构及序列情况下也可采用PCR或RNA逆转录法标探针。通常 用于Biotin 标记的探针应大于1000bp以下的探针，不易标记成功。对PCR技术来标记。近年来，Vysis 公司成功的生产些大片段的DNA探针（100-400kb）。由于控针较长故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，这不仅使杂交过程进一步简化，而且杂交信号更强。如探针是具有重复序列的DNA或粘粒、YAC探针，在杂交液中加上用超声断碎的人体胎盘组织DNA或Cot DNA,以阴断探针和染色质之间非特异性的结合。

荧光信号在高压汞灯产生的短波激发光下常引起荧光信号淬灭的发生，可将DAPI或PI稀释于P-phenlenediomine的甘油缓冲液中。任何荧光显微镜均可用于观察FISH信号，但对单拷贝探针的信号需要质量较好的荧光显微镜。如采用双色或多色滤光片可以同时观察FITC、Texas-Red等多种颜色的FISH信号，不论是染色体还是单拷贝基因的FISH信号均可用高度敏感和高分辨率的彩色胶片摄取，也可通过CCD（charge coupled device）的照相系统或Laser Scanning Confocal Imaging System（激光扫描共焦成像系统）将摄取的信号储存在计算机内，经软件处理后，将信事情显示在荧光屏上。由于有多种方法标记DNA探针，故一次杂交可以同时 观察多个探针的信号，如两个不同的探针分别用Biotin和Digoxigenin标记，杂交后用avidin-FITC和抗-Dig-Texas-Red分别与探针上的Biotin 和Digoxigenin结合，应用双色滤光片，在显微镜下就可以同时看见带有绿色荧光的FITC和红色荧光的Texas-Red信号。同理，采用三种或三种以上不同的半抗原，如Biotin,DIG和DNP等标记探针，然后用多种不同颜色的荧光素，如FITC（绿色），Rhodamine（红色），AMA或Cascade Blue（蓝色）等结合抗体进行检测，可同时得到多种不同颜色的荧光信号，如采用不同的排列组合，最多可同时检测7种不同的探针。由于常规的荧光显微镜的照像系统，彩色胶片不易多次曝光，限制了这种联合标探针的应用，使用Digital Imaging Camera System或CCD照像系统，先分别多次摄取灰色的影像关储存在计算机内，而后冠以人为的颜色，运用软件系统事例各次得到的影像，最终形成一个复合的多颜色的图像。

此外，对已做过G显带的染色体片子用75%酒精或甲醇褪色后，可再做FISH这样可更清晰的辨认各条染体及染色色体结构异常（包括某些复杂的易位，插入，倒位等）FISH和G显带技术结合不仅可以用新近G带处理过的片子，而且还可用陈旧的G带片子。因此，FISH技术可成功的帮助细胞遗传学家做出回顾性分析。

FISH技术和RFLP（Restrict Fragment Lenth Polymorphysim）结合，可以更精确地描述原必于染色体长短臂等结构改变和染色体梳型或复制片段的性质。FISH和细胞免疫化这技术结合，可以同时用多种颜色反应检测不同的核苷酸链和蛋白质，这样可以在单个细胞内同时找到基因的位点，转录和翻译和产物，有助于对核甙酸结构与功能以及基因表达产物之间关系的研究。在基因图谱绘制中，FISH和Linkage mapping结合起来，即使对具有高度多形态的基因位点也能较精确地定下来。

在细胞遗传学检查中，重复序列的探针应用最多，它们是α卫星DNA、β-卫星DNA和经典卫星DNA探针。α卫星DNA探针主要检测人染色体的着丝粒。β卫星DNA位于顶端着丝粒染色体及号染色体的异染色体质周围.经典卫星DNA（classic-saiellite DNA）有着AATGG短片段重复，位于染色体1、9、15、16和Y染色体长臂异染色质周围。后两种探针除去可用于染色体数目检查外，还可用于上述部位精细改变的检查。三种探针产生的荧光信号都在染色体着丝粒或附，因此常用于鉴定，羊水细胞可不培养直接作FISH检查，发现在21三体（Down氏综合征）、18三体（Edward综合征）、13体（Patau 综合征）、45XO（Turner氏综合征）和47XXY（Klinfelter综合征）。

FISH在白血病方面和应用较为方泛的是慢性粒细胞白血病bcr/abl易位DNA探针，采用Digoxigenin标记于22号染色体上的bcr基因，用Biotin标记位于9号染色体上的Abl基因，然后用红绿二种不同颜色的荧光素检测，慢粒常有染色体易位t（9；22）（q34；q11）而引起bcr和Abl基因的融合，这时不需要检测分裂中期细胞，在间期细胞中就可以见到二种颜色讯号的混合，从而可以确定是Ph阳性细胞。这特别适合化疗后缓解的CML，极易发现残存的白血病细胞。其它如t（15；17）易位DNA探针，t（18；21）易位DNA探针分别可用于急性早幼粒白血病（APL）和急性粒细胞白血病（AML）的诊断。此外在白血病的诊断方面，还有等位17号染色体长臂iso(17q),16号染色体长臂间倒位inv（16）探针等，都有商业出售。

在实体肿瘤方面，应用较为广泛的是HER-2/neu基因探针。乳腺癌细胞中Her/2-neu基因的扩增常预示着患者预后较差。在FISH技术之前的所有测定基因扩增的方法，都是采用经典的分子生物学方法South blotting等），但这些方法与FISH相比，不仅费时费力，而且也不可能在细胞水平上观察到基因扩增的状态。FISH技术的更大优点是可以在间期细胞核上观察到DNA扩增的直接证据，而且间期细胞核所显示出的扩增DNA荧光信号其数量多少及荧光强度常与DNA扩增的水平有关。1998年美国政府FDA批准了作为基因治疗的一种单克隆抗体Herceptin，可配合化疗来治疗部分晚期转移性乳腺癌病人，约25-30%的乳腺癌病人有HER-2/neu基因的扩增和/或过度表达。这部分病人适合Herceptin治疗、FDA在此前一些时候批准了Vysis公司的HER-2/neu基因DNA探针在乳腺癌临床诊断上的应用。HER-2/neu基因的扩增或过表达也见于卵巢癌、子宫内膜癌、涎腺肿瘤及胃癌等恶 性肿瘤。可以预，在不久的将来Herceptin和HER-2/neu基因DNA探针可用于这些肿瘤的治疗和诊断。其它一些实体瘤的肿瘤的肿瘤基因的探针如N-myc,C-myc,CyclinD1等虽有商业出售，但目前还未用于临床。

染色体x,y,21,18和13的数量变化常与先天性疾病有关。采用染色体着丝粒重复序列DNA作为探针，可以确定分裂细胞或间期细胞这些染色体的数目止，如采用21号染色体的涂抹（painting）探针，根据标记区域的大小可检测出Down氏综合征的发生。

实体肿瘤的染色体研究比较困难，这是由于获取足够量的分裂期肿瘤细胞比较困难。使用染色体着丝特异探针，对间期细胞进行染色体数量变异分析，可获得较好的结果。因此FISH技术十分有助于肿瘤细胞遗传细胞遗传学的研究。Hopman采用FISH技术研究膀胱癌，发现9号染色体的丢失。FISH检测的结果与流式细胞仪分析的结果完全一致。Waldman等发现染色体数目的改变和肿瘤的分化及分期有着密切关系，如7号染色体啬常见于有较高的Brdard分级和有较高的PCNA标记指数的晚期、恶性度高的肿瘤。Waldman认为这一现象可涉及到7号染色体上某些特殊基因的表达增加或被抑制。采用多种染色体探针，以不同的颜色标记，更适合于实体肿瘤染色体数目改变的异质性研究。

对于G或Q显带难以确定的染色体结构改变，运用FISH技术可以帮助解决。许多不能归类的标记染色体，FISH技术可以确定畸变的来源，如Miura等报告21例非小细胞肺癌（NSCLC）的染色体改变，其中一例有2个标记染色体，用FISH检测后证实是来自9号染色体的短臂梁色体上微细带的丢失，普通显带常不易发现，用特定的基因探针检测时，在正常应该有荧光信号的部位如不出现信号，表示有染色体的丢失。Lux等用Ankyrin基因作探针，检测遗传性球殂红细胞增多症病人的染色体和间期细胞，发现有这个基因的缺失。Taguchi等采用靠近3p21带附近的6个不同位点的探会，比较异常和正常3号染色体，确定胸膜间皮瘤有3p21带的缺失并推测这个区域可能存在重要的抑癌基因，为了进一步的分子生物学研究提供了重要线索。选择按一定顺序排列的基因探针，可以帮助确定染色体倒位，尤其是臂间倒位的性质，如急性白血病有16号染色体的倒位，选择两个分别位于断裂点近端和远端的粘粒探针，同时用16号染色体着丝位探针，正常细胞荧光信号的次序是：粘粒-粘粒-着丝粒，而白血病细胞的信号的次改变为粘粒-着丝粒-粘粒。

杂交细胞通常是含有单个人类染色体啮齿动物细胞。这种杂交细胞常用于绘制基因图谱或生产单个染色体特DNA库。杂交细胞在培养过程中，人体染色体极易丢失或发生染色体重排，因此，需要对杂交细胞定期进行细胞遗传学检查，采用人体组DNA作为探针或相应人体染色体涂抹探针，可以很主便的检测这些改变。

采用FISH技术，不仅可以直接确定某一DNA链在染色体上的位置，而且诮用多种颜色荧光素的标记控针，还提供了一个简单的确定基因顺序的方法。可用不同颜色荧光素标记两个不同的DNA链，而且他们在染色体上的距离大于1Mbp时，可以依据不同探针信号的排列关系分辨他们在染色体上的顺序。采用5-Burd处理的细胞，可以获得高分辨显带的染色体，从而增加DNA链标记到染色体上的分辨能力。如果使用间期细胞，两个DNA链的距离可以缩短至50Kbp，这个间距是染色体上的分辨距离的二十分之一。不同探针的次序可以通过测量其间期细胞的距离来确定。

确定DNA链在染色体上精细位置，适用于检查某些特殊的染色体易位和缺失，如涉及11号染色体q23的易位常见于急性白血t（4；11）见于急性淋巴细胞白血病（ALL），t（6；11)，5（9；11）见于急性粒细胞白血病（AML），t（11；19）见于急淋和急粒两种白血病。

标记同一DNA链与不同种必细胞的染色体杂交，可以找出不同种属之间的同源基因以及基因在染色休上的位置，从而了解种属之间的进化关系。

DNA扩增通常表现为异常的显带区域（ABRS）或异染质区（HSRS）以及无着丝微小体（DM），这些基因扩增的细胞遗传学表现在许多恶性肿瘤中。搞清楚肿瘤细胞中物定DNA链（基因）的扩增，有助于了解肿瘤的恶性增生过程。在肿留细胞中某些肿瘤因(Oncogene)的扩增，可作为预测肿瘤进展及预后的临床指征。如FISH能有效地在染色体上定位扩增的特定DNA，特别是当细胞遗传学发现在HSR或ABRS来源及位置，推测可能扩增的肿瘤基因，从而有目的检测某些基因，并能很快得到直接清晰的基因扩增的信息。Cherif等在结肠腺癌细胞中，采用FISH技术发现C-myc的扩增，而且C-myc扩增链是重排在19号染色体的长臂上。染色体上策细带的丢失，普通显带不易发现，用特定的基因探针检测时，在正常应该有荧光信号的部位如不出现信号，表示有染色体的丢失。用Ankyrin基因作探会，检测遗传性球殂红细胞增多症病人的染色体和间期细胞，发现有这个基因的缺失。有学者用FISH技术在37例B细胞淋巴瘤中发现21例（56.8%）存在6q23-24的缺失，故认为这一改变对淋巴瘤诊断有实际应用值。