一 、试剂盒内含物

.说明书亚洲 1 型口蹄疫阳性对照血清( 己稀释浓度为 1:8)

.96 孔 ELISA 板亚洲 1 型口蹄疫阴性对照血清

.液体稀释槽3% 双氧水

.U 型96孔抗原抗体反应板25×PBST洗涤液(稀释时准确量取)

.封板膜豚鼠抗血清稀释液

.灭活亚洲Ⅰ型口蹄疾病毒抗原 (用冰决包裹 )终止液

.亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒兔抗血清包被缓冲液(碳酸盐)胶囊

.亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒豚鼠抗血清底物 (柠檬酸 -磷酸盐)缓冲液片剂

.兔抗豚鼠血清IgG-辣根过氧化物酶结合物OPD片剂

二、器材准备 ( 需用户自备 )

 1.移液器:5-50µl移液器、0.2—10µl移液器、50—200µl移液器、50—300µl 12道移液器各一把。

 2.移液枪尖 (若干)。

 3.抗原抗体反应板:微量血凝板(U型、V型均可)5块,本试剂盒配备两块,用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。注:抗原抗体反应板可重复使用,实验后,用水冲洗干净,然后用无离子水沸水浴30秒,晾干,待用。

 4.超纯水 , 无离子水或蒸馏水。

三、试剂准备(需用户完成)

1.包被缓冲液(PH9.6)

   将本试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开,将胶囊内粉末倒入100ml无离子水中溶解即可。4℃存放,1月内有效。

2. 洗涤液(PBST)

   将本试剂盒配备的 25 倍浓缩 PBST 液(可能有结晶形成,用时微热溶化)用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。(如果PH降低,务必用NaOH调至7.4)

3.底物溶液

  取1片柠檬酸—磷酸盐片剂(本试剂盒配备)溶于100mL无离子水中,溶化后,取50mL溶液, 再加1片邻苯二胺(OPD)片剂,充分溶解,分装（5mL/ 瓶或 10Ml∕瓶 ), 避光之-2O℃保存。用前避光溶化 ,临时每1mL上述溶液加 10µL本试剂盒配备的 3% 的双氧水(H₂0₂) 。务必加双氧水!

四、操作步骤

 1.用包被缓冲液稀释亚洲 1 型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度(1:1000), 在 ELISA 板上每孔加 50µl, 振荡 , 封板或置湿盒内，室温过夜。

2. 抗原抗体(阴阳性对照血清及待检血清)反应

根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。

图196 孔酶标板检测 10 份样品布局图

S1 1:8	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10	+1:32	-1:4
1:16										1：64	1:8
1:32										1：128
1:64										1：256
1:128										1：512
1:256										1:1024
1:512										1:2048
1:l024										1:4096

图1 为抗体滴度测定 (定量) 检测 10 份样品布局图;图 2 为抗体滴度测定( 定量 )检测 20 份样品布局图。

图296 孔酶标板检测 20 份样品布局图

S11:32	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10	+1:32	-1:4
1:64										1:64	1:8
1:128										1:128
1:256										1:256
S111:32	S12	S13	S14	S15	S16	S17	S18	S19	S20	1:512
1:64										1:1024
1:128										1:2048
1:256										1:4096

以图1 为例 , 在 U 型血凝板上按 50 µl/孔量用 PBST 将待检 血清从1:4开始做2倍连续稀释至 1:512。同时,按图示稀释阴阳性对照血清 , 然后每孔加入 50 µl用 PBST 稀释到使用浓度的亚Ⅰ洲型口蹄疫病毒抗原 (1:4,即1份病毒抗原、加3份PBST), 病毒抗原对照孔加100µl。振荡混匀,封板,4℃过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。

3.用洗涤液 (1×PBST) 洗 ELISA板5 次,在洗水纸上甩干,再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔,每孔50µl封板,37℃温育1小时。

4.同上洗板5次, 甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度 (1:1000), 每孔加50µl,封板,37℃温育1小时。

5.同上洗板 5 次 , 甩干。用 l×PBST 稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度 (1:500), 每孔加 50 µl封板 ,37 ℃温育 1 小时。

6. 同上洗板5次,每孔加50µl底物溶液 (务必加双氧水),37℃温育15分钟。每孔再加50µl终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值(OD_492nm值)。

五、结果判定

1. 试验认可标准

每块板设 4 孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,直接用PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50µl/孔,病毒抗原对照OD492nm 值应在1.5±0.5范围内。 阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内,阴性对照血清抗体效价应＜1:8。

2.病毒抗原对照平均OD492nm 值50%计算(临界值)

抗原对照是4孔,弃去最高和最低OD492nm值,计算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以2,即50%对照值。该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD492nm值。

3.结果判定

以病毒抗原对照平均OD492nm 值的50%为临界值,被检血清稀释孔OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔,小于或等于临界值的孔为阳性孔,阳性孔的OD492nm值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均OD492nm值为1.2,则其50%为0.60。若某一待检血清在1:128时OD492nm值为0.6,则该份待检血清的抗体滴度为 1:128 。若临界值处于两个滴度之间 ,如处于1：64与1：128之间，则抗体滴度取中间值为1:9O。定性检测中 , 两个重复孔只要有 一孔为阳性孔 , 则抗体滴度判 定为 1:128, 两孔均为阳性孔 , 则判定 为抗体滴度＞1:128 。

ELISA抗体效价≥1:128,判定为亚洲 1 型口蹄疫抗体阳性。

ELISA抗体效价与保护力的关系:牛、羊:抗体效价≥1:128,99% 保护；效价≤1:16, 不保护；效价在1:22-90之间,50%保护。

猪瘟正向间接血凝试验试剂使用说明书

一、原理

用己知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验，亦称间接血凝。抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下形成抗原——抗体复合物。但这种复合物的分子团很小人肉眼看不见。将抗原吸附(致敏)在红细胞表面，制成猪瘟血凝抗原，用于检测免疫动物血清中的猪瘟抗体水平。

这种经过猪瘟抗原致敏的红细胞与猪瘟抗体相遇，红细胞便出现清晰的凝集现象。

二、适用范围

主要用于检测猪瘟免疫抗体效价，以便制定正确的免疫程序，保障猪群免遭猪瘟强毒的感染。

三、试验器材，

1、96孔110^。V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板。

2、1微量移液器(50微升、25微升)取液塑料咀。

3、微量振荡器。

4、猪瘟血凝抗原

5、猪瘟阴性对照、血清。

6、猪瘟阳性对照血清。

7、稀释液。

8、待检血清（每头约0.5ml血清即可）。

四、试验方法

1、加稀释液

在血凝板上1～6排的1～9孔；第7排的1～4孔第6孔；第8排的1～12孔各加稀释液50微升。

2、稀释待检血清

取1号待检血清50微升加入第1排第l孔，并将塑咀插入孔底，右手拇指指轻压弹簧1～2次混匀(避免产生过多的气泡)，从该孔取出50微升移入第2孔，混匀后取出50微升移入第3孔……直至第9孔混匀后取出50微升丢弃。此时第1排1～4孔待检血清的稀释度(稀释倍数)依次为:1:2（1）、1:4(2)、1:8(3)、1:16(4)、1:32(5)、1:646)、1:128(7)、1:256(8)、1:512(9)。

取2号待检血清加入第2排:取3号待检血清加入第3排……均按上法稀释，注意!每取1份血清时，必须更换塑咀一个。

3、稀释阴性对照血清

在血疑板上的第7排第1孔加阴性血清50微升，对倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃。此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2(1)1:4(2)1:8(3)1:16(4)。第6孔为稀释液对照。

4、稀释阳性对照、血清

在血凝板上的第8排第1孔加阳性血清50微升，对倍稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃。此时阳性血清稀释倍数依次为1:2～1:4096。

5、加血凝抗原

被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血请各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原(充分摇匀，瓶底应无血球沉淀)25微升。

6、振荡混匀

将血凝板置于微量振荡器上振荡1～2分钟，如无振荡器；用手轻轻摇匀亦可。然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下或37℃下静置1.5～2小时判定结果，也可延至翌日判定。

7、判定标准

移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:16孔，稀释液对照孔，均应无凝集(血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点)，或仅出现凝集(血球大部沉于孔底，边缘稍有少量血球悬浮)。

阳性血清对照、1:2～1:256各孔应出现“++～++++”凝集为合格，(少量血球沉入孔底，大部血球悬浮于孔内)。

在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清1～5孔呈现“++～++++”凝集，6～7孔呈现“++”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集，那么就可判定该份血清的猪瘟抗体效价为1:128。

接种猪瘟疫苗的猪群免疫抗体效价达到1:16(即第4孔)呈现“++”凝集为免疫合格。

五、检测试剂性能要求

1、性状

(l)液体血凝抗原：摇匀呈棕红色(或咖啡色)，静置后，血球逐渐沉入瓶底。

(2)阴性对照血清：淡黄色清亮稍带粘性的液体。

(3)阳性对照血清：微红或淡黄色稍混浊带粘性的液体。

(4)稀释液：淡黄或无色透明液体，低温下放置，瓶底易析出少量结晶，在水浴中加温后即可全溶，不影响使用。

2、包装

(１)液体血凝抗原：摇匀后即可使用，5ml/瓶，每瓶检测3040头份血清。

(2)阴性血清：2ml/瓶，直接稀释使用。

(3)稀释液：100ml/瓶，直接使用4℃保存。

3、保存条件及保存期

(l)液体血凝抗原：4℃保存(切勿冻结)，保存期4个月。

(2)阴性对照血清：-15～-20℃保存，有效期2年，4℃保存有效期半年。

(3)阳性对照血清:-15～-20℃保存，有效期2年，4℃保存有效期半年。

六、注意事项

1、为使您的检测获得正确结果，请您在检测前仔细阅读本说明书。

2、严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。

3、勿用90^。和130^。血凝板，以免误判结果。

4、本法可单独检测猪瘟抗体水平，也可同步检测口蹄疫免疫抗体水平。

5、用过的血凝板应及时在水龙头下冲净血球。再用蒸馏水或去离子水冲洗2次，甩干水份放37℃恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒，37℃干燥备用。

6、每次检测只做一份阴性、阳性和稀释液对照。、

“-”表示完全不凝集或0～10%血球凝集；

“+”表示10-25%血球凝集；“+++”表示75%血球凝集；

"++"表示50%血球凝集；“++++”表示90～100%血球凝集。