纯化高转染级别的质粒DNA 

【工作台流程】BENCH PROTOCOL

准备工作：

1.将RNase A 溶液加入P1缓冲液(Buffer P1)

2.加40ml96－100％乙醇(ethanol)于试剂盒的去内毒素水中(endotoxin-fre water)

3.可选：加 LyseBlue 试剂于 Buffer P1

4.检查 Buffer P2是否有SDS沉淀precipitation 有沉淀可在37摄氏度下暖化溶解

5.Buffer P3 置于4摄氏度中预冷pre-chill

6.细菌扩增培养

补充：

1. 准备4-6个50ml新的或灭菌的离心管用于冷冻离心机下离心过夜菌液，2个用于接下来的菌块重悬和与buffer混合
2. 1个无内毒素的30ml聚丙烯（不推荐聚碳酸酯，因为不耐乙醇）管子（最好用圆底的离心管以利于高速离心）用于收集洗提的质粒DNA
3. 5个1.5ml的EP管用于收集抽提过程各步骤的产物用于实验后分析和质量控制
4. 准备1个冰浴盒用于步骤6
5. 准备室温下的异丙醇10.5ml
6. 4摄氏度冰冻离心机和分光光度仪,琼脂糖凝胶电泳

步骤：peocedure

A.细菌培养、收获和裂解 bacterial culture,harvest & lysis

1.100ml高拷贝high-copy或250ml低拷贝low-copy过夜overnight LB培养菌液于冰冻离心机4摄氏度； 6000×g；15min

   从新鲜的抗生素平板上挑取一个单菌落，2-5ml抗生素LB液体初始培养基30摄氏度孵化约8小时（振荡300rpm，注意孵化容器容积至少4倍于培养液）

   抗生素LB液体培养基稀释初始培养液到1:500-1000。(高拷贝质粒100-200ul初始培养液加于100ml培养基；低拷贝质粒250-500ul初始培养液加于250ml培养基)37摄氏度300rpm振荡12-16小时。(孵化容器容积至少4倍于培养液，培养至细菌密度约3-4×10⁹/ml，即离心后菌块湿重约3g/L培养基)

   培养基配方：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化钠 溶于800ml蒸馏水，用1 N NaOH 调pH值至7.0，用蒸馏水调整至1L。

   可将离心后菌块-20摄氏度下冰冻保存暂时终止实验。

2.于10ml Buffer P1中重悬浮resuspend细菌沉淀bacterial pellet，混匀

   必须重悬彻底，涡流振荡器或移液器反复吹打至没有菌块

3.加入10ml Buffer P2，剧烈vigorously翻转invert4-6次混合，置于incubate室温5min

   在室温孵化期间准备QIAfilter 过滤筒cartridge：在滤筒出水口outlet喷嘴nozzle拧上screw帽子，将滤筒置于管架备用

  加入buffer P2后不要使用涡流振荡器(以免剪切细菌DNA)，裂解反应不要超过5分钟。buffer P2用完要拧紧盖子以免酸化。

4.加10ml预冷的 Buffer P3，剧烈翻转4-6次混合

加入buffer P3后析出绒毛样物质(细菌DNA，蛋白，细胞碎片和KDS)，裂解液粘性下降。如果裂解液仍然粘稠度大，说明混合不够。

很重要的是混合好后迅速倒入滤筒，以防止扰动沉淀层。

B.细菌裂解清除 bacterial lysate clearing

5.将裂解液倒入pour滤筒内，置室温(15-25摄氏度)10min，不要套入滤筒活塞plunger！从喷嘴处取掉滤筒的帽子，缓慢轻柔的将活塞插入滤筒并滤过细菌裂解液于50ml试管中

   在静置的10分钟里不要搅动滤筒内的裂解液。析出物会慢慢上浮于上层。如果过了10分钟析出物未浮在上层，可用消毒的移液器枪尖驱赶滤筒壁上的析出物。

   取120ul过滤后裂解液样本(Sample1)用于实验后分析胶，确定生长和裂解条件是否最佳。

6.加2.5ml Buffer ER 到过滤好的裂解液中，翻转约10次使其混合，冰浴30min

C.结合、洗涤和抽提质粒DNA bind,wash & elute plasmid DNA

7.用10ml Buffer QBT 平衡equilibrate QIAGEN-tip 500，并保持重力流动gravity flow排空柱筒empty column

8.使用第6步骤得到的过滤裂解液加入QIAGEN-tip柱中使其重力流动通过树脂resin

   取120ul通过树脂后的裂解液样本(Sample2)用于实验后分析胶，确定质粒DNA结合于树脂的效率。

9.2×30ml Buffer QC洗涤QIAGEN-tip

   第一步洗涤质粒准备过程中大多数污染物，第二步洗涤特别针对培养液过多或所用菌种含糖量较多的情况。

   取240ul洗涤液样本(Sample3)用于实验后分析胶

   注意：以下步骤均为无内毒素操作，需使用无内毒素的聚丙烯塑料管或预处理的玻璃器皿(消毒后180摄氏度烘箱过夜)

10.15ml buffer QN 抽提DNA

   用30ml的无内毒素管子收集。如果质粒DNA大于45-50kb，将抽提缓冲液QN 65摄氏度预热后使用会提高产量

   取60ul洗提样本(Sample4)用于实验后分析胶

   可将洗提液存于4摄氏度保存以暂停实验，但时间不宜过夜。

D.沉淀、洗涤和再溶解质粒DNA precipitate,wash & redissolve plasmid DNA

11.加入10.5ml室温异丙醇(isopropanol)到抽提的DNA中并混合。4摄氏度冰冻离心机>=15,000×g，30min离心，小心的去上清dacant the supernatant

    尽管离心在4摄氏度离心机下以防止样本过热，但所有溶液须为室温以减少盐沉淀。离心前可在离心管上标记以明确离心后DNA斑块的位置。

12.用5ml 70％室温的去内毒素乙醇(去内毒素水中加入40ml 96-100％乙醇)洗涤DNA沉淀，>=15,000×g，10min离心。小心去上清避免扰动沉淀

13.空气中干燥air-dry沉淀5-10min，重新溶解DNA到适量的去内毒素的 Buffer TE 中。

    冲洗管壁以完全重新溶解所有DNA(特别是用玻璃管的话)。但不要用移液器吹打以免剪切DNA。过于干燥的DNA斑块很难重新溶解。酸性环境有助于DNA溶解。

E.产量测定

14.260nm紫外分光光度计：A₂₆₀ 0.1-1.0之间

    琼脂糖凝胶电泳

15.如果产量很低则将前述Sample用于电泳分析问题所在。