为保证及时、科学地采集、运送人粒细胞无形体病病例（包括疑似病例）及疫源地调查的各种类型标本，规范人粒细胞无形体病的实验室检测程序，提高检测质量，为明确诊断或开展相关的科学研究提供实验室依据，特制定本方案。

一、样本采集对象

（一） 人粒细胞无形体病病例（包括疑似病例，以下同）。

（二） 病例密切接触者或其他健康人群。

（三） 疫源地可疑宿主动物（野生动物及狗、羊、牛等家畜）、媒介蜱。

二、标本种类及采集方法

（一） 抗凝血。

常用EDTA抗凝管或枸橼酸盐抗凝管采集血液5ml，用于病原分离。应尽可能在病人使用抗生素前进行血液的采集。

（二）非抗凝血。

用无菌真空管，采集病例、健康人群及宿主动物非抗凝血5ml，用于血清抗体及PCR检测。采集后，应及时分离血清，将血清、血球分别保存。急性期抗体及PCR检测用血液采集尽可能在发病后1周内，恢复期抗体检测标本采集至少间隔2-3周。如第2份血清在1个月之内抗体升高不明显的，应建议间隔2-4周后采集第3份血液标本。

（三）包涵体检测血涂片的制备。

采集血液标本后，制作厚血片，进行红细胞裂解处理等。

（四）媒介蜱标本的采集。

采集动物体表媒介蜱，用镊子夹取，放入铺垫有潮湿滤纸或纱布的青霉素小瓶或试管中，用纱布包紧瓶口以防止蜱爬出。实验室接到蜱标本后，首先应进行种属鉴定，然后按类别分组（1-5只蜱/组），采用75%酒精浸泡30min后，用无菌蒸馏水反复冲洗3次。最后进行分组研磨，研磨液用于提取DNA，进行PCR扩增。

（五）有条件时，可采集活检或尸检标本，冰冻、福尔马林固定或石蜡包埋后进行实验室检测。具体方法参照病理实验室相关要求和卫生部《传染病人或疑似传染病人尸体解剖查验规定》的相关要求。

三、标本采集和保存注意事项

标本采集应符合无菌操作要求。抗凝血如不能立即床边接种，应置于4℃环境保存，避免冰冻（不超过2周）。非抗凝血应及时进行无菌分离血清，血清用于抗体检测，血球部分研磨后提取DNA用于PCR检测。如不能及时检测，可暂置于－20℃环境保存。所有标本应置入大小适合、带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，拧紧管口。

标本采集后，应认真填写采样登记表。

四、实验室检测

（一）包涵体的检测。

1. 血片及白细胞涂片制备

采集的抗凝血标本尽快用血球层推血片，待干燥后冷丙酮固定10min；或提取抗凝血中的白细胞并进行涂片，待干燥后冷丙酮固定10min。

2. 染色

通常采用瑞氏（Wright）染色法、姬氏(Giemsa)染色法及瑞－姬混合染色法。有条件的实验室，可使用美国CDC推荐的染色方法。

3. 染液配置方法

（1）瑞－姬染液：取瑞氏染料和姬氏染料各0.5 g，以甲醇研溶，加甲醇500ml保存，每天摇匀１次，１周后可使用。
    （2）改良Mc Donald法瑞－姬染色剂：75 ml甘油（分析纯）中加入磷酸盐缓冲液（Na₂HPO₄ 1g和KH₂PO₄ 2g），以4 ml蒸馏水溶解，37 ℃水浴24 h溶解混匀，用滤纸过滤，保存于密封的棕色瓶中备用。上述甘油缓冲液1.5 ml加瑞－姬染色剂50 ml，混匀后备用。

4. 染色步骤

血推片或白细胞涂片分别以两种染色剂染色2 min，再加蒸馏水作用5 min，用自来水冲洗。
    5. 结果观察

中性粒细胞中可见桑葚状包涵体（见图1），并注意保存相关标本，以便进行复核。

（二）血清学检测。

常用血清学方法为间接免疫荧光（IFA）法。采集急性期（发热初期，一般发病1周内）与恢复期（至少间隔2-3周）双份血清。如恢复期血清抗体检测阴性，应建议医生采集第3份血液样本（间隔2-4周）。

1. 试剂 

使用国际推荐的、经过ISO质量认证的产品。

2. 方法及操作按说明书进行。

3. 结果解释

IFA检测结果解释按说明书进行。

如果同时检测双份血清，IgG抗体4倍升高，则结果强烈支持嗜吞噬细胞无形体感染。如果急性期抗体升高，而恢复期没有升高或轻微升高，则应采集第3份血液样本（间隔2-4周）进行进一步检测。

（三）嗜粒细胞无形体核酸PCR检测。

目前，国际推荐使用16S rRNA基因检测方法，有条件的实验室，可进一步选用热休克蛋白基因groEL扩增方法。

1. DNA提取

用急性期、未使用抗生素的EDTA抗凝血或非抗凝血血球部分、白细胞及蜱研磨液提取DNA。最后，以AE缓冲液50µl抽滤以提高回收的DNA浓度。如采用血液白细胞层提取DNA，可明显提高阳性检出率。实验时，应采集当地正常人血液同时提取DNA，作为PCR的阴性对照。

2. PCR扩增

（1）16S rRNA基因检测：16S rRNA 高度保守，是PCR检测最常用的扩增靶基因，巢式PCR检测可提高检测灵敏度和特异度，采用属特异及种特异引物同时进行检测。PCR检测应分区进行，避免污染。使用引物序列见表1。

表1  巢式PCR检测无形体及埃立克体16S rRNA基因常用引物

引物名称	序 列	片段长度(bp)
Eh-out1(AF414399)	5’-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3’	653
Eh-out2(AF414399)	5’-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3’
Eh-gs1(AF414399)	5’-GTA ATA CT GTA TAA TCC CTG-3’	282
Eh-gs2(AF414399)	5’-GTA CCG TCA TTA TCT TCC CTA-3’
HGA1	5’-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG -3’	389
HGA2	5’-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3’

 

PCR反应混合物的准备按常规进行。第一轮反应采用外引物对Eh-out1和Eh-out2，DNA模板10µl（白细胞提取的DNA可适当减少）。PCR反应体系总体积为25µl或50µl（需要进行PCR测序或克隆时，应适当扩大反应体系），其它成分的浓度按常规进行。反应程序如下：

94℃  5min

40循环：94℃  45sec

        55℃  50sec

        72℃  1min

72℃  总延伸 5min

第二轮反应使用2对引物分别进行巢式PCR。2对引物分别是无形体属及埃立克体属通用内引物（Eh-gs1、Eh-gs2）；以及HGA种特异性引物（HGA1及HGA2）。检测样本取第一轮产物1-2µl为模板，阳性对照取0.5µl为模板。反应程序同第一轮反应。

（2）热休克蛋白基因groEL扩增

与groEL基因的应用相比，16S rRNA基因的应用更为广泛，但groEL基因在不同种属间具有较大的变异性。因此，对于诊断及菌株的鉴定，groEL基因均具有重要意义。该基因扩增使用巢式PCR，引物序列见表2。

表2  groEL基因扩增常用引物   

引物名称	序  列	退火温度	片段长度bp)
HS1	5’-TGG GCT GGT  A（A/C）TGA AAT	52℃	1431
HS6	5’-CCI CCI GGI ACI  A（C/T）ACC TTC
HS43	5’-AT（A/T）GC（A/T） AA（G/A）GAA GCA TAG TC	55℃	HGA480
HS45	5’-ACT TCA CG（C/T）（C/T）TCA TAG AC		HME528

DNA提取同上。PCR检测时，反应混合物的准备按常规进行。DNA模板量同16S rRNA基因检测。巢式PCR第一轮反应采用外引物对HS1及HS6。

反应程序如下：

 3循环：94℃ 1min

         48℃ 2min

         70℃ 90sec

37循环：88℃ 1min

          52℃ 2min

          70℃ 90sec

 68℃ 总延伸 5min

第二轮PCR引物采用HS43及HS45。检测样本取第一轮产物1-2µl为模板，阳性对照取0.5µl为模板。反应程序同第一轮反应。反应程序同第一轮反应，但退火温度由52℃改为55℃。

3．测序及分析

对扩增产物进行测序并进行同源比较，分析当地流行株与其它地区的变异性。

（四）病原体分离培养。

多用HL-60进行嗜吞噬细胞无形体的分离培养。最常用的分离方法是将白细胞部分接种培养基，然后将100-500µl抗凝血接种到悬浮有2×10⁵或1×10⁶细胞内, 每2-3天染色检查包涵体，一般5-10天可查见包涵体。由于分离可能受到红细胞的影响，因此，建议使用以下方法：

1.白细胞分离：采用密度梯度离心方法（Ficoll-Paque）。一般采用2-3 ml EDTA抗凝血，用2倍体积的无菌Hanks 平衡盐溶液稀释，最后采用Histopaque（Sigma，St . louis, Mo）密度梯度离心分离白细胞，可以获得较高的白细胞，用以分离HGA。采用白细胞分离方法进行接种时，应注意防止操作过程中的污染。

2. 红细胞裂解后收集白细胞（NHCl₄裂解法）。

3. 在使用含有红细胞的标本培养后，另加入宿主未感染的细胞，建立混合培养。

血液白细胞悬浮于2ml体积、含有5-10%胎牛血清的培养基中，且在25 cm²培养瓶内与培养细胞作用3小时。37℃、5% CO₂ 条件下振摇孵育，可增加病原体与细胞的作用。

病原体的鉴定：可通过种特异引物进行PCR鉴定。

五、生物安全

在标本采集、运输及实验室工作过程中，生物安全应参照《病原微生物实验室生物安全管理条例》中的有关要求进行。

（一）实验室生物安全。

标本灭活、病原DNA标本提取及病原体分离操作应在生物安全Ⅱ级实验室进行。非感染性材料的检测可在生物安全I级实验室进行。

（二）血液标本采集安全注意事项。

采集病例的标本时，应做好个人防护。采集者应戴乳胶手套，尽量避免病例的血液外溢或直接接触。如发生血液外溢污染环境时，应及时采用75%酒精或常用消毒剂进行消毒处理。应按照对传染性样本的要求，对采集标本的器具及病人止血棉球及时进行消毒处理。防止锐器扎伤皮肤，一旦发生，应按临床外科要求，及时进行伤口清创。如直接沾染了临床诊断病例或确诊病例的血液，除及时消毒皮肤外，应口服强力霉素预防感染，服用剂量参照《人粒细胞无形体病诊疗方案（试行）》（附件1）。

（三）采集动物宿主与媒介蜱标本个人防护。

野外采集标本时，应穿着颜色明亮的防护服，并将衣袖或裤管口扎紧以防蜱叮咬人体，且容易发现蜱的附着。一旦发现有蜱附着体表，应用镊子夹取，不要用手直接摘除。野外作业或活动的人员可使用驱避剂或防蚊油喷涂皮肤，也可用硫化钾代替防蚊油。

（四）标本运输安全注意事项。

应参照《病原微生物实验室生物安全管理条例》中的有关要求（B类）进行。

（五）在诊疗及标本的采集、包装和实验室检测等过程中所产生的医疗废物，应按照《医疗废物管理条例》和《医疗卫生机构医疗废物管理办法》等相关规定处理。