广州健仑生物科技有限公司研究所.徐华

●用途原理

    ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫检测技术，具有敏感特异、简便实用、标准稳定等特点，已经成为被广泛采用的检测手段。然而，ELISA的工作准备烦琐而复杂，许多试剂需要临时配置，不仅费时费力，而且影响结果的重复性。

    为此，我公司吸收国内外先进技术，结合自身成熟工艺，开发出通用的即开即用ELISA试剂盒，适应于各种抗原抗体ELISA的建立。该盒几乎囊括了ELISA自包被到结果判断过程中所需的各种关键性试剂，并已加工成工作状态，达到开盒即用的效果；同时还提供了具体详细的操作流程和注意事项，可以协助操作者顺利完成ELISA试验。

    试剂盒让ELISA操作变得简单、方便！

●试剂组成

1.空白微孔板(48/96T)             1套;		5.显色剂TMB (4号液)              1瓶;
2.酶结合物稀释液(1号液)      1瓶;		6.样本稀释液 (5号液)       1瓶;
3.洗涤剂 (2号液)          1瓶;		7.终止液    (6号液)      1支;
4.底物（3号液）                      1瓶		8.使用说明书             1份;

●操作程序

包被流程

1.将包被蛋白用包被液按比例稀释，参考浓度5ug—50ug/ml不等，纯度高的蛋白浓度可以低一些，反之亦然；充分稀释后，按100ul/孔准确加样。2-8℃18小时。

2.甩去孔中液体，用0.05M氯化钠溶液注满各孔，再甩去。

3.加入封闭液，充分溶解混匀。按120ul/孔加入各孔。37℃2小时，甩去后拍干即可使用。临时保存可以放入自封袋内，密封后置于2-8℃保存。

检测流程

1.  样本稀释:用样本稀释液(5号液)将待检样本按合适比例稀释(一般间接法ELISA为1：100)。

2.  加样反应:每孔加已稀释样本100ul。同时设阴性、阳性及空白对照各一孔。空白对照孔 加入100ul样本稀释液(5号液)。37℃温育,时间一般为30-60分钟，甩去，每孔加洗涤液(2号液)一滴,立即用蒸馏水加满，静止30秒，甩去；如此洗涤五次,甩去,拍干。 

3.  加酶反应:将酶结合物用酶结合物稀释液(1号液)按参考比例稀释，而后按100ul/孔加入, 37℃反应30-60分钟。甩去,加洗涤液(2号液)一滴,立即用蒸馏水同上洗涤五次,甩去,拍干。

4.  显色反应:加底物(3号液)和显色剂(4号液)各一滴，混匀, 37℃下放置3-10分钟,加终止液(6号液)一滴混匀,终止反应。

●结果判断

1．肉眼观察:浅于近于阴性对照为阴性; 呈明显深于阴性对照的蓝色为阳性。

2．仪器判断:450nm读取O.D值,待检孔O.D值大于阴性对照2.1倍者为阳性.空白对照调零。当阴   性对照O.D值低于0.07时,按0.07计算。

●     问题与技巧

ELISA是一种敏感的免疫学检测方法，容易受到各种因素的干扰。要保证实验的可靠性，必须注意每个环节。以下是常见的问题以及相关的解决方法：

1 包被不上抗原（抗体）：

* 包被抗原应是可溶性的，不溶性蛋白结合性能很差，比如一些重组蛋白包涵体、组蛋白、胶元旦白或脂类抗原。

解决：可以采用改变包被液PH，采用尿素溶解，改变溶剂等方法将抗原变为可溶性。

* 包被抗原分子量太小，如合成多肽类。

解决：可以采用共价键结合模式，包被抗原。

* 包被抗原的浓度不够。

解决：可以适当提高包被抗原量或选取高吸附包被板，但过度包被会形成叠层，反而影响实际

结合量，甚至造成本底升高。

* 包被液PH不当会改变蛋白质的电荷状况，直接影响空间结构及抗原表位。

解决：可以测定等电点（PI），并系列改变PH，以寻求最适的PH值。

此外，在包被抗体时，适当预先低度变性，可以增加包被量。

 

2 本底很高

* 抗原本身不纯，如有交叉表位，或有杂蛋白成分等。

解决：杂蛋白可以通过盐析、层析纯化去除；而交叉表位处理较为复杂，需要在表位选择时认真考虑。

* 包被板封闭不佳，在包被板上留有较多的空白。

解决：提高封闭剂浓度，选择更有效的封闭蛋白。

* 样本问题，首先是稀释不够：间接法ELISA一般要求血清稀释在1：50以上，其它体液可以浓度大一些；

解决：系列稀释样本，以选择最佳比例。

* 其次，样本高脂、高色素、溶血以及污染长菌，都有可能造成本底上升；

解决：要采用新鲜无溶血标本，低温冻存。

* 最后可能与样本稀释液有关，样本稀释液的PH、离子强度等都会影响非特异性结合；

解决：可以采用可靠的样本稀释液或自行调整PH、缓冲系等条件。

* 酶浓度过高，造成非特异性上升；

解决：应当选择恰当酶浓度。

 

3 反应强度不够

* 除与抗原活性、包被效果相关外，主要受酶结合物性质和浓度的影响。一般，稀释后的酶结合物失活很快，半衰期仅3天。

解决：采用本试剂盒的酶稀释液可以有效保护酶活性，大大延长酶反应能力。此外，采用高纯度的二抗（有亲和层析的单克隆抗体酶最佳）。

延长反应时间也可以一定程度提高反应强度。

 

4 显色问题

* 全部白板。原因与漏加酶液，酶液失活，显色体系失效等。

  解决：可以取确认正常的酶液20ul，直接滴加底物和显色剂各一滴，观察显色情况。正常应在60秒钟出现明显兰色，否则，应认为显色体系有问题，需要更换。

* 肉眼观察颜色很深，酶标仪读数却很低。如仪器工作正常，往往是选择的波长不匹配。

解决：TMB显色剂被硫酸终止后，呈黄色，应在450NM处测定（注意：另外一种显色剂OPD则在492NM测定）。

* 定量测定抗原或抗体时，线性范围窄。

  解决：ELISA的反应在O.D值0.2-1.0区间较为稳定，超出以后，系统误差加大，变得不太稳定。可以在调整反应到此区间。

 

5 操作过程中的其它问题与解决，见附表：