1.       目的

制定沙门氏菌属诊断血清使用程序，指导对沙门氏菌属进行血清学分型。

2.       原理

用沙门氏菌属的代表菌株制成灭活菌抗原分别或混合免疫家兔所得的血清，经吸收出去非特异性凝集素后制成，通过凝集试验原理供沙门氏菌属常见菌型定型。

3.       试剂及实验设备

3.1    沙门氏菌属诊断血清

3.2    试剂保存：2~8°C避光保存，防止冻结，在有效期内使用。

3.3    实验设备：玻片、吸样枪、接种环、水浴箱、玻璃管、血平板、营养琼脂、电热高温接种灭菌器。

4.       程序步骤

4.1    将诊断血清于冰箱取出后平衡至室温。

4.2    选择经初步生化检测符合沙门菌生物特性的疑似菌落。

4.3    菌群分析

将经18~24h血平板上纯培养的待检菌，先用O多价A~F群血清进行凝集试验，如阳性，提示待检菌可能属于A~F群范围内，因97%以上的沙门菌都包括在A~F6个O群之内，如果不凝再使用其他O抗血清进行凝集试验，如与其中一种抗血清凝集，待检菌即属于相应的菌群。若与多价O抗血清不凝集，有如下3种可能：①含有Vi抗原；②A~FO群之外的沙门菌；③沙门氏菌属以外的细菌。可按下述方法进一步检测，将纯菌落用无菌生理盐水洗下，制成浓菌液，再分成2份。1份不经处理，为活菌液，另1份放100°C水浴中30min，为加热菌液。取活菌与Vi抗血清，取加热菌与Vi抗血清凝集，加热菌与Vi抗血清、A~F多价O抗血清分别进行玻片凝集试验。根据结果作如下分析：①活菌与Vi抗血清凝集，加热菌与Vi抗血清凝集者，可能属于C群或D群菌，用O₇和O₉抗血清定群；②活菌与Vi抗血清不凝，可能属于A~FO群之外的沙门菌或其他菌属细菌，需进行生化试验定属，若符合沙门氏菌属细菌特征，可送CDC鉴定；③加热菌与Vi抗血清凝集，而与A~F多价O抗血清不凝集者，可报告为阴性。

4.4    血清型分析

菌群确定后，分析被检菌的鞭毛抗原成分。先分析第1相鞭毛抗原，再分析第2相鞭毛抗原。第1相鞭毛抗原分析：根据菌群分析结果，分别选用第1相鞭毛因子血清进行玻片凝集试验。第2相鞭毛抗原分析：所用抗血清，通常是复合因子（1、2、3、5、6、e、n、I、w）血清。单相菌，如第1相已确定，可结合菌群分析及生化反应结果判断血清型。如为双相菌，只分析出第1相鞭毛抗原，大多数也可结合菌群分析和生化结果判断血清型，必要时进一步探索第2相鞭毛抗原。若只分析出第2相鞭毛抗原，须进一步探索分析第1相抗原。探索另1相抗原可按下述方法和步骤进行。如“小内管”法，一支已融化半固体琼脂，插入一支无菌两端相通小玻璃管于培养基当中，长度稍高出半固体液面。待琼脂泠却凝固，用接种环取1~2环待抑制相H抗血清，放入小内管的琼脂表面，然后接种被诱导菌株于小内管含抗血清琼脂层面，35°C孵育4~6h或过夜，取小内管外半固体琼脂层生长培养物，接种于平板或直接做凝集反应，可获得待诱导相的菌株。有些种的确定是靠鞭毛抗原中的微小差异来分析的，因而获得丰富鞭毛抗原的培养物十分重要。

4.5    将经18~24h血平板上纯培养的待检菌，用生理盐水制备2麦氏单位的菌悬液，取诊断血清20μL于洁净玻片上，然后取20μL待检菌悬液与血清混匀，轻轻摇动玻片，1min内呈现明显凝集者为阳性，呈均匀浑浊者为阴性，每次凝集试验均应以生理盐水作为阴性对照试验。

4.6    根据其生化反应和与O抗血清、Vi抗血清、H抗血清的凝集结果对照沙门氏菌属国内常见菌型诊断抗原表，确定沙门菌的菌型。

4.7    沙门氏菌属国内常见菌型诊断抗原，见附表

5.       质量控制

O多价A~F群血清选择伤寒沙门菌ATCC14028为阳性对照；大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照

6.       质量记录

7.       参考文献

[1]     卢锦汉主编.医学生物制品学.北京.人民卫生出版社.1995

[2]     中国生物制品规程（2000年版）.北京.化学工业出版社.2000

附表：沙门氏菌属国内常见菌型诊断抗原表