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美国进口西尼罗病毒检测试剂盒到货!

2013-7-15 16:57:28      点击:
 西尼罗病毒IgG/IgM检测试剂盒

用途

美国FOCUS西尼罗河(West Nile)病毒IgG ELISA,利用了西尼罗重组抗原检测人体血清或血浆中的西尼罗抗体。本实验仅用于辅助诊断人感染了西尼罗病毒,不用于筛查血液或血液成分。仅供专业人员体外诊断使用。

概述

 感染了西尼罗病毒会导致包括脑炎等一系列症状的疾病,西尼罗病毒在世界广泛传播,已在50多个国家检测出该病毒。本试验经CDC提供的试剂检验与验证。本试验使用了一种称为WNRA的重组抗原,它可以作为西尼罗病毒感染的快速血清学指标,WNRA蛋白是一种重组抗原,它是由含有西尼罗病毒两个抗原的序列多肽构成。

实验的原理

检测西尼罗病毒IgG ELISA 是基于两步夹心法原理制造的。

提供的材料

1.        微孔板(96孔 12x8):即用 每孔均包被结合西尼罗重组抗原的单抗。2-8℃下保存至保质期。

注意:WNRA和NCA已包被于微孔板。

2.        IgG样品稀释液:1支 25ml 即用 2-8℃下保存至使用。

3.        IgG阴性质控:1支 30ul  2-8℃下保存至使用。要长时间储存,将其分装于小瓶里,在-70℃下储存。

4.        IgG阳性质控:1支 30ul  2-8℃下保存至使用。要长时间储存,将其分装于小瓶里,在-70℃下储存。

5.        洗涤液(10X):1瓶 120ml  2-8℃下保存至使用。

6.        EnWash:1瓶 20ml 2-8℃下保存至使用。

7.        酶联物:一瓶6ml 即用 2-8℃下保存至使用。

8.        TMB底物液: 1支 9ml 即用  2-8℃下保存至使用。

9.        终止液;1支6ml 即用 2-8℃下保存至使用。

试剂应避免反复冻融。

操作步骤

在使用前将所有试剂和样品平衡至室温,并轻轻倒转使其充分混匀。

实验准备:

将10X的浓缩洗涤液稀释,将120ml的浓缩洗涤液加上1080ml的蒸馏水,摇匀,至无任何沉淀,稀释好的洗涤液最多可在室温下放置两个星期。

准备实验所需的板条,剩余的板条应尽快放入袋子里重新密封,在2-8℃下储存至保质期。

操作步骤

1.     标记将要使用的板条,注意微孔板已经按照统一排列,如下所述包被西尼罗抗原和质控抗原。


西尼罗抗原

 

板条#1

板条#2

A

WNRA

WNRA

B

WNRA

WNRA

C

WNRA

WNRA

D

WNRA

WNRA

E

NCA

NCA

F

NCA

NCA

G

NCA

NCA

H

NCA

NCA


2.     将血清样品﹑阴性质控和阳性质控同样地用样品稀释液按1:300稀释。

3.       每孔加入50ul稀释后的样品,以下为一个血清样品使用一个板条的典范。


 

板条1

板条2

血清样品

A

IgG N

样品1

B

IgG N

样品1

C

IgG P

样品2

D

IgG P

样品2

E

IgG P

样品2

F

IgG P

样品2

G

IgG N

样品1

H

IgG N

样品1

       


4.       封板,在湿润的温育器里37℃下温育1小时。

5.       温育后,用自动洗板机,使用洗涤液洗板6次。

6.       在每孔中加入50ul的酶联物。

7.       封板,在湿润的温育器里37℃下温育1小时。

8.       温育后,用自动洗板机,使用洗涤液洗板6次。

9.       每孔加入150ul的EnWash,在室温下温育5分钟

10.   温育后,用自动洗板机,使用洗涤液洗板6次。

11.   每孔加入75ul的TMB底物液。

12.   封板,在室温下,避光处温育10分钟。

13.   每孔加入50ul的终止液终止反应。

14.   在450nm处读取吸光率。

结果的计算

结果的变化将会非常大,以下结果仅供指引。

计算ISR值:

计算在同一实验里WNR抗原的两个阴性质控的平均值,计算同一实验里NC抗原的两个阴性质控的平均值,用WNRA/NCA,得出阴性质控的ISR值。同样地计算阳性质控和样品得ISR值,阳性质控的ISR值应高于3.0,阴性质控的ISR值应低于1.5。


ISR

结果

解释

≤2.0

阴性

没有检测到IgG抗体

2.0-3.0

可疑

需确证实验

≥3.0

阳性

存在IgG抗体,建议做确定性实验


结果的判断:

在某些特殊的例子中,曾报道有假阳性,但对梅毒病人无限制。假如样品的ISR值大于2.0,但是WNRA和NCA的OD值均偏低,可视为潜在假阳性。以下为样品1排除标准的范例。

排除标准:

计算阴性质控的WNRA和NCA值:


 

WNRA

NCA

NO.1

0.153

0.126

NO.2

0.125

0.110

总计

0.260

0.236


平均WNRA=0.260/2=0.130

     NCA=0.236/2=0.118

     ISR=0.130/0.118=1.10

任何阴性质控的ISR值高于1.5,则实验需要重做。

计算阳性质控的WNRA和NCA值:


 

WNRA

NCA

NO.1

0.635

0.190

NO.2

0.655

0.178

总计

1.290

0.368


平均WNRA=1.290/2=0.645

     NCA=0.368/2=0.184

     ISR=0.645/0.184=3.5

任何阳性质控的ISR值低于3.0,则实验需要重做。

以下标准是必需遵守的,不满足以下标准,试剂出现了质量问题或操作错误,实验需重做。


因素

范围

平均阴性质控读数

<0.400

平均阳性质控读数

>0.400

阳性质控的ISR值

>3.000

, ,

阴性质控的ISR值

<1.500


解释结果

1.       样品的ISR值大于3.0视为阳性。

2.       阳性结果需重做证明。

3.       样品的ISR值小于2.0视为阴性。

4.       样品的ISR值小于3.0但是大于2.0,视为未确定,但是很有可能阳性,实验需一式三份重做。

5.       ISR值大于2.0是因为WNRA和NCA的值都低造成的,应该视为潜在假阳性。

样品1低OD值的范例:
计算样品的WNRA和NCA值:


 

WNRA

NCA

NO.1

0.044

0.190

NO.2

0.016

0.007

总计

0.060

0.026


平均WNRA=0.060/2=0.030

     NCA=0.026/2=0.013

     ISR=0.030/0.013=2.31

虽然样品的ISR值高于2.0,但是本样品需视为假阳性,因为其OD值低,而且远远偏离了相关的标准品,这通常在空白值高的情况下发生。

要进一步证实样品,所有阳性的结果都要用6,2层析稀释滴定法重做,与相同滴定法的阴性质控相比较,假如曲线是??的,平的或者是波浪型的曲线,则表明为假阳性的结果。

实验的局限性

1.           样品的OD值高于抗原质控(非WNRA),导致ISR值小于3.0,则可能为假阴性,再释稀样品重新实验,可能会获得真正的ISR值。

2.          既然这不是一个直接检测的方法,则需考虑假阳性和假阴性存在的可能性。

3.          所有有反应的样品,应用确定性实验来证实。

4.          本实验提供的试剂,尽可能地检测血清或血浆中的WNRA反应性抗体水平。

5.          应避免反复冻融样品和试剂。

6.          不要使用溶血或脂血的样品,它们会导致错误的结果。

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该说明书由健仑生物技术人员编译,请与英文原文为准,谢谢!