技术文档   Support
联系我们   Contact
搜索   Search

登革热​IgM 捕捉ELISA 法(MacELISA)实验

发布时间:2014-3-8 9:20:13      浏览次数:
登革热IgM 捕捉ELISA 法(MacELISA)实验


试验材料:

(1)抗原:
阳性抗原:采用C6/36 细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。
阴性抗原:未接种病毒的正常C6/36 细胞为阴性抗原对照。
(2)抗人IgM(μ 链)单克隆抗体或多克隆抗体;
(3)登革病毒IgM 阳性、阴性对照血清;
(4)辣根过氧化物酶标记登革病毒单克隆抗体;
(5)缓冲液:
洗涤液:pH7.4 PBS-T(0.05%吐温-20);
稀释液:pH7.4 PBS(5%牛血清);
封闭液:pH9.6 碳酸缓冲液(1%牛血清白蛋白);
(6)显色液:A/B 液
(7)终止液:4N H2SO4
(8)酶标板、酶标仪。
检测步骤:
(1)用稀释液按效价稀释抗人μ 链单克隆抗体,100μl/孔,加盖,4℃过
夜;
(2)弃去抗人μ 链,用洗涤液重复洗3 次,甩干,加封闭液,100μl/孔,
置37℃水浴孵育2 小时;
(3)弃封闭液,用洗涤液重复洗3 次,甩干。
(4)将待检血清用稀释液从1:10 开始作2 或4 倍连续稀释,加入酶标板

孔中,100μl/孔,同时加入已1:10 稀释的阳性血清、阴性血清对照各4 孔,

100μl/孔,置37℃水浴孵育2 小时;
(5)弃去血清,用洗涤液重复洗3 次,甩干,分别加4 个型DV 抗原及阴性
抗原对照,100μl/孔,4℃过夜;
(6)弃抗原,用洗涤液重复洗3 次,甩干,加用稀释液稀释至工作浓度的
相应的登革热酶标单克隆抗体,正常抗原加4 个型混合的酶标单克隆抗体,
100μl/孔,37℃水浴2 小时;
(7)弃去标记物,用洗涤液重复洗3 次,甩干,于各反应孔内加A/B 液各一滴,37℃,避光3~5 分钟;
(8)加终止液于每反应孔,一滴/孔。
结果判断:
(1)目测方法:
阳性对照孔呈明显蓝色,阴性对照孔呈无色,对照成立;若待检血清孔呈明
显淡蓝色或深蓝色(TMB),则标本为登革热IgM 抗体阳性,反之阴性。
(2)酶联免疫检测仪检测:
于450nm(TMB)阳性对照孔OD 值/阴性对照孔OD 值,即P/N≥2.1,对照成
立;若待检血清孔OD 值与阴性对照孔OD 比值≥2.1,则标本为登革热IgM 抗体
阳性,反之阴性。(阴性对照孔OD 值小于0.05 按0.05 记,若大于0.05 按实际
数值计算)
意义:
阳性结果,表明患者新近DV 感染,用于登革热早期诊断。